JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Subcutánea angiotensina II infusión usando osmótica Bombas Induce aneurismas aórticos en ratones

Published: September 28, 2015
doi:
10.3791/53191
, , , , , ,
1Saha Cardiovascular Research Center,University of Kentucky, 2Department of Pharmacology and Nutritional Sciences,University of Kentucky

Summary

La implantación subcutánea de bombas osmóticas proporciona un enfoque conveniente para suministro prolongado y consistente de compuestos. Este enfoque ha sido utilizado ampliamente para estudiar las dos aneurismas de la aorta abdominal y torácica en ratones.

Abstract

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 – 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Introduction

Los aneurismas aórticos exhiben expansión luminal permanente de la aorta que presagia ruptura y por lo general conduce a la muerte. Esta enfermedad se presenta en las dos regiones de la aorta abdominal y torácica, que se denominan como aneurismas aórticos abdominales (AAA) y aneurismas de aorta torácica (TAA), respectivamente. Debido a una comprensión incompleta de los mecanismos moleculares y procesos fisiopatológicos, no hay ninguna terapia médica probado que puede impedir la expansión o ruptura de cualquiera de los tipos de aneurismas aórticos. Puesto que es difícil de adquirir muestras de pacientes y realizar experimentos en seres humanos directamente, la investigación se centra en la definición de mecanismos de los AAA ha sido extrapolado frecuencia de los modelos animales. Un modelo animal comúnmente usado es la infusión subcutánea de la angiotensina II (AngII) en ratones. En comparación con otros métodos quirúrgicos para inducir AAA en ratones, como la perfusión elastasa intra-aórtica o aplicación peri-aórtica de cloruro de calcio que requieren laparotomía 1,2, esto method no requiere entrada en la cavidad del cuerpo y requiere experiencia quirúrgica mínimo 3,4.

Infusión subcutánea de AngII a través de bombas osmóticas para inducir AAAs se informó inicialmente en baja densidad de lipoproteínas receptor (LDL) – / – ratones alimentados con una dieta enriquecida en grasa saturada 3, y posteriormente en apoE – / – ratones alimentados con una dieta normal de laboratorio 4. Muchos estudios recientes también han demostrado que induce AAAs AngII en ratones normolipidémicos 5-7. El enfoque de la infusión de AngII se ha aplicado para inducir los AAA y explorar mecanismos moleculares así como el desarrollo de estrategias terapéuticas potenciales (por ejemplo, 5-15) ya que este modelo recapitula muchas características observadas en los AAA humanos. Por ejemplo, los factores de riesgo de AAA humanos, como el tabaquismo, la edad y el género masculino también aumentan los AAA inducidos por angiotensina II en ratones 16,17. La asociación de hipercolesterolemia con AAA en el ser humano requiere aclaración. Sin embargo, tiene seres coherente que la hipercolesterolemia aumenta AngII inducida AAA en ratones 18. Patologías de los AAA inducidas por AngII en ratones son muy heterogénea y se caracterizan por la infiltración de macrófagos profunda, la degradación del colágeno, la formación trombótica y la resolución, y la neovascularización 19-21. En contraste con la ubicación de aorta infrarrenal más común de los AAA en los seres humanos, AngII inducida en ratones AAAs se producen en la región aórtica suprarrenal. Otra característica ubicua de inducida por Ang II AAA es la ruptura medial transmural, que conduce a la trombosis transmural. No está claro si la ruptura elastina transmural se produce en los seres humanos desde el desarrollo patológico de los AAA en los seres humanos no se ha estudiado exclusivamente debido a la falta de tejidos aneurismáticas de etapas anteriores.

AngII infusión en ratones también conduce a la profunda expansión de la región de la aorta torácica, que está restringida principalmente a la aorta ascendente que es la región más común para TAA en los seres humanos <sup> 19,22-26. Similar a los AAA inducidos por angiotensina II, TAA inducida durante AngII infusión también recapitular muchas características de AAT humana 25. Sin embargo, a diferencia de los AAA inducidos por angiotensina II, TAA inducidos por angiotensina II no están asociados con la hipercolesterolemia y no tienen diferencias de género.

El objetivo general de la infusión de Ang II subcutánea en ratones es el estudio de las características patológicas y mecanismos moleculares de la AAA y la AAT.

Protocol

Declaración de Ética: Mouse estudios se llevan a cabo con la aprobación de la Universidad de Kentucky Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC número de protocolo: 2006-0009). Los ratones se sacrificaron a la terminación usando un cóctel de ketamina sobredosis (~ 210 mg / kg) y xilazina (~ 30 mg / kg). 1. Cálculo de la angiotensina II Importe NOTA: Este protocolo utiliza el ejemplo de infusión de AngII (1,000 ng / kg / min) durante 4 semanas en 4 receptor de LDL macho – / – ratones alimentados con una dieta enriquecida en grasa saturada. Pesar estudiar los ratones antes de calcular la cantidad de angiotensina II necesaria para perfusión. Utilice la plantilla (Tabla 1) para calcular la masa AngII necesaria para el experimento. Utilice la opción "Mean bombeo Rate" se indica en la Instrucción de bombas como la "tasa de bombeo" en el paso 4 de la plantilla. En la plantilla, ficha Pasos 1-5 manualmente y Pasos 6-10 se calculan automáticamente. En la plantilla, asumir queratones ganará 1 g de peso corporal durante la infusión de AngII 1000 ng / kg / min durante 4 semanas. NOTA: Cada ratón puede tener el aumento de peso corporal muy diferente que dependerá de muchas variables, tales como la cepa de ratón y la dieta. Utilizamos rutinariamente "0" o "1 g", basada en la propia experiencia de los estudios anteriores. Calcula un volumen total de 300 l de solución de Ang II para cada ratón desde cada bomba requiere aproximadamente 250 l. 2. Disolución de AngII Tienda liofilizado viales AngII a -20 ° C. Equilibrar viales AngII a RT antes de abrir. Pesar la masa AngII calculado (7,3 mg, como se muestra en la Tabla 1) en un tubo de plástico estéril. NOTA: Por Merck Index, no utilice tubos de vidrio para la disolución ya una solución acuosa de angiotensina II tiene una fuerte afinidad por la unión a vidrio. Añadir el volumen calculado de solución salina estéril (1.200 μl) en el tubo de plástico que contiene el liofilizado AngII, gorra, y mezclar bien por inversión hasta que la solución es clara. Números Label ratón # 1, # 2, # 3 y # 4 en los tubos de plástico estériles individuales con tapas (0,5 – 1,5 ml). Preparar la solución de AngII bajo una campana laminar para cada ratón según el peso corporal, calculado en el paso 1.2 y en la Tabla 1. Por ejemplo, una pipeta 3,6 l de solución salina estéril en el tubo # 1, entonces la solución AngII 296,4 l, y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo con suavidad. Números de la etiqueta del ratón en tubos de plástico con tapas (4 ml, estériles). Estos serán utilizados para la incubación de las bombas como se describe en el Paso 3,13. 3. Relleno bomba osmótica Obtener bombas en dos partes separadas: el cuerpo principal de la bomba y el moderador de flujo (Figura 1). Cada caja tiene 10 cuerpos de bomba y moderadores de flujo que se envuelven individualmente. Anote el número de lote. NOTA: Siempre useguantes porque aceites transferidos desde las manos a la carcasa exterior de bombas afectarán negativamente a la función de bombeo. Use guantes estériles, gasas, tubos, agujas de llenado, y sopesar los barcos para preparar las bombas, para evitar el riesgo de infección del implante. Abra sólo el número de cuerpos de bomba y moderadores de flujo necesarios para el estudio, ya que estos no pueden ser almacenados una vez abiertos. Si se necesitan más de 10 bombas, asegúrese de que los números de lote de las bombas son las mismas para un estudio, ya que las bombas de distintos lotes tienen diferente volumen de llenado media y bomba Rate. Pesar cada bomba (incluyendo tanto el cuerpo principal y moderador de flujo), y tenga en cuenta el peso de 4 decimales (por ejemplo, 1,1443 g de ratón # 1). Este peso, denominada "bomba de Peso en vacío" en la plantilla (tabla 1), se utilizará para calcular la relación de llenado. Coloque la aguja de llenado de la bomba a una jeringa estéril de 1 cc y llenar cuidadosamente la jeringa con solución de Ang II de la forma adecuadatubo de plástico numerada. Es importante evitar que entre aire en la jeringa. Eliminar todas las burbujas de aire y cuidadosamente la jeringa mientras la aguja está colocada hacia abajo. Mantenga la aguja / jeringa en esta posición para evitar la introducción de burbujas dentro de la bomba. Introduzca suavemente la aguja de llenado en el cuerpo de la bomba. Avanzar en la punta de la aguja dentro de la bomba. No se apoye con la punta de la aguja firmemente en la parte inferior de la bomba. Empuje el émbolo de la jeringa lentamente para llenar la bomba con una solución de Ang II. Una sombra oscura dentro de la bomba indica el nivel de llenado. El volumen de llenado es de aproximadamente 246 l, según las instrucciones. Deje de llenar la bomba y retire con cuidado la aguja tan pronto como una gota de fluido se levanta de la bomba. Inserte moderador de flujo en la bomba a través del orificio en la parte superior del cuerpo de la bomba hasta que no se ve brecha entre la cabeza del moderador de flujo y la parte superior del cuerpo de la bomba (Figura 1). La inserción de moderato en el cuerpo de la bomba conduce a alguna pérdida de líquido de la apertura de la moderador de flujo. Borrar cuidadosamente todo exceso de líquido que podría haber escapado durante la colocación de los moderadores. Pesar bomba llena. Anotar el peso bajo "Bomba Peso Lleno" en la plantilla. Calcula grado de llenado (%) = (Bomba de Peso "lleno" – "vacío") x 1.000 / significa llenar el volumen x 100. Calcula Razón de llenado como se indica en la Tabla 1. Idealmente, llenando relación debe ser igual o mayor que 100%. Bomba de llenado si el grado de llenado es <95% (implicando que las burbujas de aire puede estar presente en la bomba). Coloque la bomba de llenado en el tubo marcado con 4 ml (Paso 2.5), con frente a la cabeza moderador hacia arriba. Añadir un volumen suficiente de solución salina estéril para cubrir la bomba. Mantenga la bomba en el tubo de solución salina hasta la implantación. Colocar los tubos en una incubadora a 37 ºC. Incubar las bombas de O / N (por lo menos 12 hr) para permitir el cebado parcial, y luego implantar en ratones. Bombación de Ang II comienza aproximadamente 24 horas después de la implantación, que permite a los ratones para recuperarse de la cirugía antes de cualquier posible estrés que surge durante AngII infusión. 4. Preparación para la implantación de la bomba Autoclave (modo de gravedad, ciclo de secado, 15 min) gasas, torundas de algodón y herramientas quirúrgicas incluyendo tijeras, pinzas hemostáticas, pinzas, grapas y grapadora al menos 1 día antes de la cirugía. En una sala de procedimientos, preparar vaporizador para la anestesia utilizando isoflurano. Abre paños estériles en una campana de flujo laminar, y coloque cono de la nariz para la anestesia isoflurano. Coloque betadine, etanol al 70%, agua estéril, esterilizador de cuentas, preparado de antiséptico, torundas, gasas, y bombas llenas en una campana laminar. Don una mascarilla y bata, a continuación, abra una cortina exterior en una campana laminar con las manos limpias. Póngase los guantes estériles y abrir el paquete en el interior estéril. 5. Procedimiento quirúrgico de la implantación de la bomba Coloque el ratón en un cham inducciónber con flujo de entrada de isoflurano a una velocidad de flujo de 1,5 – 2%. Monitorear el ratón durante 2 – 3 minutos después de decúbito. Afeitarse un área aproximadamente del tamaño de un cuarto, sobre el hombro izquierdo o derecho. Coloque ratón en una campana laminar, con su nariz a ras con un cono conectado al flujo de salida isoflurano (Figura 2A). Coloque la cabeza del ratón hacia la mano dominante del cirujano. Use ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Asegúrese de que el ratón no tiene respuesta a la estimulación del dolor antes de la cirugía. Por ejemplo, la respuesta del pedal es un buen indicador para el dolor. Swab y limpie zona afeitada con betadine seguido de tres toallitas con etanol al 70%. Don o cambiar los guantes estériles. Utilice un bisturí quirúrgico para hacer una incisión ~ 1 cm detrás de la oreja sobre la lámina del hombro de la pata delantera. Esta incisión debe ser perpendicular a la cola. Tenga cuidado de cortar tejidos solamente la piel y no subyacente. Hold forceps en una mano para abrir la incisión, y el uso de la otra mano para hacer un túnel subcutáneo debajo de la piel usando una pinza hemostática (Figura 2B). Avanzar punta pinza hemostática hacia la cola, y crear un bolsillo para la bomba. Esto se logra abriendo cuidadosamente las mandíbulas de la pinza debajo de la piel para abrir una bolsa. Retirar la pinza de incisión. Inserte la bomba dentro de la incisión con la cabeza moderador posicionado en la parte trasera del ratón (Figura 2C). Empuje suavemente la bomba completamente en el bolsillo. Debe haber suficiente espacio libre para cerrar la herida sin tensión o estiramiento de la piel. Una vez que una bomba ha sido insertada, apriete firmemente ambos lados de la incisión, enderezar para que los bordes se encuentran, y colocar 1 o 2 clips para cerrar la herida (Figura 2D). Inspeccionar el sitio de la incisión para asegurar que no es el cierre completo de la herida, y que la bomba no está presionando directamente en el sitio. Aplicar crema de lidocaína tópica(4% p / p) con un limpio ratón swab.Remove algodón desde el cono de la nariz, y lo coloca en una almohadilla caliente hasta que se recupera la conciencia. Después de recuperarse, el ratón se devuelve a su jaula. Coloque los instrumentos quirúrgicos en un esterilizador de cuentas durante 10 segundos entre los ratones. Dejar enfriar antes de su uso. Guantes limpios con preparado de antiséptico entre los ratones. Controlar todos los ratones hasta que se logra la recuperación completa. Supervise de cerca los ratones después de la cirugía. Inyectar un bolo de solución salina estéril (0,2 – 0,3 ml) por vía subcutánea si un ratón muestra signos de sufrimiento, la deshidratación o pérdida de peso aparente. Observar los ratones al menos dos veces al día durante los primeros 10 días, y al menos una vez cada día posteriormente. Realice una necropsia inmediatamente si algún ratones mueren durante AngII infusión. Retire los clips de la herida entre los 7 – 14 días después de la cirugía. 6. La recolección, Reparación, Servicio de limpieza, e Imagen de aortas Cortar abrir el tórax del ratón y cavidades abdominales ventral, corte open aurícula derecha, perfundir con solución salina a través del ventrículo izquierdo del corazón para eliminar la sangre en la aorta, y luego cosechar la aorta 27. Coloque aortas recolectadas en tubos de plástico que contienen al menos 3 ml de paraformaldehído al 4% o 10% de formalina tamponada neutra durante 24 – 48 h 27. Retire tejidos adventicia cuidado. Aorta Pin en cera negro con alfileres. Adquirir imágenes de la aorta con el mismo aumento. Incluir una regla en cada imagen para la calibración, como se muestra en la Figura 3. 7. En la cara de imagen de aortas Cortar aorta abierta longitudinalmente a través de la curvatura exterior e interior del arco aórtico, y cortar ramas principales abiertas incluyendo innominada, arteria carótida izquierda y la arteria subclavia izquierda. Pin aorta plana con adventicia externa que pone al lado de la cera negro. Adquirir imagen en la cara de la superficie de la íntima de la aorta con la misma ampliación. Incluir una regla en cada imagen para la calibración, como se muestran en la Figura 4.

Representative Results

Los 4 del receptor de LDL masculina – / – ratones descritos en la sección Protocolo fueron sacrificados después de 4 semanas de AngII infusión. Aortas se recogieron, se limpian, y la imagen para visualizar dilataciones aórticas. Como se muestra en la Figura 3, aortas tienen varias características diferentes, incluyendo la expansión de la región suprarrenal (AAA; Figura 3a), la expansión de la región ascendente (AAT; Figura 3B), o la expansión de ambas regiones (presencia tanto de los AAA y AAT; figura 3C), mientras que la morfología de un ratón fue macroscópicamente normal (Figura 3D). La dilatación de la aorta abdominal se cuantifica midiendo la anchura ex vivo máxima de la región suprarrenal, como se ilustra por la línea roja en la Figura 3A. Para medir la dilatación de la aorta ascendente, aortas fueron cortadas abierto y puestas como se muestra en la Figura 4. Área de superficie de la íntima se midió en la región de la aorta ascendente (área rodeada por The líneas rojas en la figura 4A) para cuantifican TAA. Una regla se incluyó en cada imagen para normalizar las mediciones, como se muestra en ambas figuras 3 y 4. . Figura 1. Imagen Representante de bomba osmótica llena Cada bomba contiene dos partes: un cuerpo principal y un moderador de flujo. Después de llenar el cuerpo de la bomba con AngII, el moderador de flujo se inserta para sellar la bomba. Figura 2. Proceso de la cirugía de implantación de la bomba (A) del ratón se coloca en una campana laminar con un cono de nariz que es continuamente la liberación de isoflurano y oxígeno.; (B) una pinza hemostática recta se inserta en la incisión de la piel para hacer un túnel subcutáneo; (C) de la bomba se inserta a través de la incisión de la piel con suavidad; (D) La incisión de la piel se grapa después de la inserción de la bomba. Figura 3. imágenes aórtica (ex vivo) de ratones infundidos con AngII AngII 1000 ng / kg / min se infundió en receptor de LDL hombre -. / – Ratones durante 28 días. (A) AAAs acompañada de trombosis; La línea roja (2,05 mm) muestra la medición de la anchura máxima de la aorta en la región suprarrenal. (B) Ascendente dilatación aórtica (TAA) con aorta abdominal macroscópicamente normal; (C) dilataciones profundos tanto en el ascenso y regiones de la aorta suprarrenal (TAA y AAAS); (D) de la aorta macroscópicamente normal sin aparente dilatación del ascendente o región de la aorta suprarrenal. 4.jpg "/> Figura 4. In caras de las regiones de la aorta torácica de ratones infundidos con AngII AngII 1.000 ng / kg / min se infundió en el receptor de LDL masculina -. / – Ratones durante 28 días. Superficie esbozado por una línea roja representa la región de la aorta ascendente incluyendo parte del arco aórtico. 1 Dosis requerida 1000 ng / kg / min 2 Comience peso corporal (el más grande del ratón) 24.8 g 3 Ganancia de peso corporal total estimado 1 g 4 Velocidad de bombeo 0.25 l / h 5 Number de los ratones 4 6 Dosis por hora para los animales 1518 ng 7 Conc necesaria 6072 ng / l 8 Por 300 solución ul 1.82 mg / l 300 SOLUCIÓN ES NECESARIO 9 AngII total (mg) 7.3 mg 10 Disuelto en solución salina y# 160; 1200 l Ratón Peso corporal Factor de dilución Volumen (l) Bomba Peso (g) Relación de Llenado # (g) AngII Saline Vacío Lleno (%) 1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1.3877 99 2 23.0 0.9 278.2 21.8 1.1677 1.4145 100 3 24.8 1.0 300.0 0.0 1.1438 1.3904 100 4 21.8 0.9 263.7 36.3 1.1438 1.3904 100 Factor de dilución = peso corporal del peso del ratón / cuerpo del ratón más grande Ratón Peso corporal Factor de dilución Volumen (l) Bomba Peso (g) Relación de Llenado # (g) AngII Saline Vacío Lleno (%) 1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1.3877 99 2 23.0 0.9 278.2 21.8 1.1677 1.4145 100 3 24.8 1.0 300.0 0.0 1.1438 1.3904 100 4 21.8 0.9 263.7 36.3 1.1438 1.3904 100 Tabla 1: Cálculo de la infusión de 28 días a través de bombas osmóticas.

Discussion

Las bombas osmóticas entrega de Ang II por vía subcutánea es un método de rutina para la inducción de los aneurismas de aorta en ratones. Basado en datos de muchos laboratorios, ha habido hallazgos consistentes que este es un método fiable y reproducible para estudiar tanto AAAs 3,4 y 22-26 de AAT en ratones. Por lo tanto, este modelo de ratón se considera un modelo que recapitula varias características de los aneurismas aórticos humanos y proporciona una visión mecanicista en estas enfermedades devastadoras.

Mientras que el envejecimiento es un factor de riesgo de AAA en los seres humanos, no se ha estudiado sistemáticamente por los AAA inducidos por angiotensina II en ratones. Sin embargo, parece incidencia y la gravedad de los AAA inducidas por AngII son similares en ratones a la edad de 8 – 48 semanas 4,5,7. En la actualidad, sólo hay unos pocos estudios que informaron TAA inducidos por angiotensina II en ratones a la edad de 8 – 24 semanas 22-26, que no presenten diferencias relacionadas con la edad aparente sobre la formación de TAA.

Mujeres ratones tienen una incidencia mucho menor de los AAA de ratones machos infundidos con AngII 4,28. También vale la pena señalar que la incidencia de la inducida por Ang II AAA es mucho mayor en hipertensión que los ratones normo-cholesterolemic, que es más del 50% frente a menos del 30%, respectivamente. Además, es frecuente rotura de la aorta (aproximadamente 10 – 30%) tanto en ratones normo e hipercolesterolémicos durante AngII infusión. La infusión de Ang II a una velocidad de 1,000 ng / kg / min en ratones hipercolesterolémicos, tales como el receptor de LDL – / – ratones alimentados con una dieta o apolipoproteína Western (apoE) – / – ratones alimentados con una dieta normal o Western, tiene efectos máximos sobre AAA desarrollo 3,4,29. Esta velocidad de infusión es óptima para un estudio en el que se espera la manipulación de un gen de interés en ratones hipercolesterolémicos para reducir los AAA. Si se espera que una manipulación en ratones hipercolesterolémicos para aumentar AAAs, se recomienda para infundir AngII a una velocidad de 500 ng / kg / min o más baja 30. En contraste con los AAA, no hay ninguna demostraciónasociación nstrated entre el género masculino o la hipercolesterolemia y la inducida por Ang II TAA 25. Sin embargo, de manera similar a los AAA, si se espera que la manipulación de un gen de interés para aumentar la AAT, se recomienda una velocidad de infusión menor que 1000 ng / kg / min para AngII infusión.

También es importante saber que la incidencia y la gravedad de los aneurismas aórticos inducida por AngII varían entre los ratones individuales y entre los estudios. Si los ratones no desarrollan aneurismas de aorta, una posibilidad potencial es que Ang II puede que no se han entregado con éxito en ratones. Para la validación de una alta tasa de infusión de Ang II, en kg min, se recomienda como 1000 ng / / medición de la presión arterial antes de, y durante, la infusión de Ang II utilizando un método de cola-brazalete no invasiva 31. AngII infusión a una velocidad de 1,000 ng / kg / min aumenta la presión arterial sistólica en ratones. Además, las concentraciones de renina en plasma se pueden medir durante AngII infusión o en la terminación desde Ang II tiene un voto negativo de rsecreción enin. Por lo tanto, la infusión de AngII conduce a reducciones en las concentraciones de renina en plasma. Si un ratón infundido con Ang II no tiene patologías aparentes aórticas, sin aumento de la presión arterial, y no hay disminución de la concentración de la renina plasmática, que indicaría que Ang II no se ha entregado de manera eficiente a través de la mini-bomba osmótica implantada. Le recomendamos quitar este ratón del estudio. También es importante señalar que algunos ratones no desarrollan aneurismas aórticos pesar del aumento de la presión arterial sistólica y la disminución de las concentraciones plasmáticas de renina. Estos ratones deben permanecer en el estudio.

En resumen, AngII infusión se consigue mediante la implantación subcutánea usando bombas osmóticas para inducir aneurismas de la aorta en ratones. Este método ofrece AngII constantemente a una tasa definida para duraciones designadas que se utilizan para estudiar tanto los AAA y TAA.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The research work presented in this manuscript was supported by a grant (HL107319 to Alan Daugherty and HL107326 to Lisa A. Cassis) from the National Institutes of Health of the United States of America. The content in this manuscript is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. The publication of this manuscript was sponsored by DURECT Corporation.

Materials

Angiotensin II Bachem H-1705 compound used to induce aortic aneurysms
Alzet Osmotic Pumps DURECT Corporation Alzet Model 2004 feasible for 28-day infusion in mice weighed > 20 g
Saturated fat-enriched diet Harlan Teklad TD.88137 42% calories/calories to stimulate hypercholesterolemia in LDL receptor -/- mice
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pyo, R., et al. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest. 105 (11), 1641-1649 (2000).
  2. Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride. J Surg Res. 99 (2), 371-376 (2001).
  3. Daugherty, A., Cassis, L. Chronic angiotensin II infusion promotes atherogenesis in low density lipoprotein receptor -/- mice. Ann NY Acad Sci. 892 (1), 108-118 (1999).
  4. Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. J Clin Invest. 105 (11), 1605-1612 (2000).
  5. Deng, G. G., et al. Urokinase-type plasminogen activator plays a critical role in angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm. Circ Res. 92 (5), 510-517 (2003).
  6. King, V. L., Trivedi, D., Gitlin, J. M., Loftin, C. D. Selective cyclooxygenase-2 inhibition with celecoxib decreases angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 1137-1143 (2006).
  7. Uchida, H. A., Poduri, A., Subramanian, V., Cassis, L. A., Daugherty, A. Urokinase-type plasminogen activator deficiency in bone marrow-derived cells augments rupture of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (12), 2845-2852 (2011).
  8. Wang, Y. X., et al. Angiotensin II increases urokinase-type plasminogen activator expression and induces aneurysm in the abdominal aorta of apolipoprotein E-deficient mice. Am J Pathol. 159 (4), 1455-1464 (2001).
  9. Bruemmer, D., et al. Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice. J Clin Invest. 112 (9), 1318-1331 (2003).
  10. Gavrila, D., et al. Vitamin E inhibits abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin II-infused apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (8), 1671-1677 (2005).
  11. Wang, J., et al. IgE actions on CD4+ T cells, mast cells, and macrophages participate in the pathogenesis of experimental abdominal aortic aneurysms. EMBO Mol Med. 6 (7), 952-969 (2014).
  12. Yoshimura, K., et al. Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase. Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).
  13. Usui, F., et al. Inflammasome activation by mitochondrial oxidative stress in macrophages leads to the development of angiotensin II-induced aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 127-136 (2015).
  14. Mellak, S., et al. Angiotensin II mobilizes spleen monocytes to promote the development of abdominal aortic aneurysm in apoe-/- mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 378-388 (2015).
  15. Krishna, S. M., et al. Peptide antagonist of thrombospondin-1 promotes abdominal aortic aneurysm progression in the angiotensin II-infused apolipoprotein-E-deficient mouse. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 389-398 (2015).
  16. Norman, P. E., Curci, J. A. Understanding the effects of tobacco smoke on the pathogenesis of aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (7), 1473-1477 (2013).
  17. Daugherty, A., Powell, J. T. Recent highlights of ATVB: aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 691-694 (2014).
  18. Liu, J., Daugherty, A., Lu, H. Angiotensin II and abdominal aortic aneurysms: an update. Curr Pharm Design. , (2015).
  19. Rateri, D. L., Howatt, D. A., Moorleghen, J. J., Charnigo, R., Cassis, L. A., Daugherty, A. Prolonged infusion of angiotensin II in apoE(-/-) mice promotes macrophage recruitment with continued expansion of abdominal aortic aneurysm. Am J Pathol. 179 (3), 1542-1548 (2011).
  20. Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (9), 1621-1626 (2003).
  21. Daugherty, A., Cassis, L. A., Lu, H. Complex pathologies of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. J Zhejiang Univ Sci B. 12 (8), 624-628 (2011).
  22. Daugherty, A., Rateri, D. L., Charo, I. F., Owens, A. P., Howatt, D. A., Cassis, L. A. Angiotensin II infusion promotes ascending aortic aneurysms: attenuation by CCR2 deficiency in apoE-/- mice. Clin Sci (Lond). 118 (11), 681-689 (2010).
  23. Rateri, D. L., et al. Endothelial cell-specific deficiency of Ang II type 1a receptors attenuates Ang II-induced ascending aortic aneurysms in LDL receptor-/- mice). Circ Res. 108 (5), 574-581 (2011).
  24. Rateri, D. L., et al. Depletion of endothelial or smooth muscle cell-specific angiotensin II type 1a receptors does not influence aortic aneurysms or atherosclerosis in LDL receptor deficient mice. PLoS One. 7 (12), 10-1371 (2012).
  25. Rateri, D. L., et al. Angiotensin II induces region-specific medial disruption during evolution of ascending aortic aneurysms. Am J Pathol. 184 (9), 2586-2595 (2014).
  26. Davis, F. M., et al. Smooth muscle cell deletion of low-density lipoprotein receptor-related protein 1 augments angiotensin II-induced superior mesenteric arterial and ascending aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 155-162 (2015).
  27. Daugherty, A., Rateri, D. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice. Methods. 36 (2), 129-138 (2005).
  28. Henriques, T. A., Huang, J., D’Souza, S. S., Daugherty, A., Cassis, L. A. Orchidectomy, but not ovariectomy, regulates angiotensin II-induced vascular diseases in apolipoprotein E-deficient mice. Endocrinology. 145 (8), 3866-3872 (2004).
  29. Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Antagonism of AT2 receptors augments angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms and atherosclerosis. Br J Pharmacol. 134 (4), 865-870 (2001).
  30. Wang, S., et al. Deficiency of receptor-associated protein attenuates angiotensin II-induced atherosclerosis in hypercholesterolemic mice without influencing abdominal aortic aneurysms. Atherosclerosis. 220 (2), 375-380 (2011).
  31. Daugherty, A., Rateri, D., Lu, H., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. J Vis Exp. (27), e1291 (2009).

Tags

Subcutaneous InfusionAngiotensin IIOsmotic PumpsAortic AneurysmsMiceHypercholesterolemiaGender DependenceAbdominal Aortic AneurysmsThoracic Aortic Aneurysms

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lu, H., Howatt, D. A., Balakrishnan, A., Moorleghen, J. J., Rateri, D. L., Cassis, L. A., Daugherty, A. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J. Vis. Exp. (103), e53191, doi:10.3791/53191 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image