使用渗透皮下血管紧张素Ⅱ输液泵诱导主动脉瘤小鼠

伦理声明：鼠标研究与肯塔基州机构动物护理和使用委员会（：2006-0009 IACUC协议号）的大学批准执行。小鼠用氯胺酮（〜210毫克/千克）和赛拉嗪的过量鸡尾酒（〜30毫克/千克）在安乐死终止。 对血管紧张素Ⅱ金额1.计算注：此协议使用输液血管紧张素Ⅱ（1000毫微克/公斤/分钟）的例子，连续4周在4个男性低密度脂蛋白受体 – / – 小鼠喂食饱和脂肪，丰富的饮食。 称重计算需要输液血管紧张素Ⅱ的量前研究小鼠。 使用的模板（表1）来计算所需要的实验的AngII的质量。使用“平均泵送率”中的泵中的模板的步骤4的“抽气速率”的指令表示。手动5和步骤6 – – 在模板中，记录步骤1 10自动计算。 在模板中，假设老鼠会获得1克体重注射的血管紧张素Ⅱ1000纳克/ kg / min的4周期间。 注意：各鼠标可以具有非常不同的体重增加，这将取决于许多变数，如小鼠品系和饮食。我们经常使用“0”或“1克”的基础上从先前的研究我们自己的经验。 计算血管紧张素Ⅱ溶液300μl总体积为每只小鼠因为每个泵需要约250微升。 2.溶解血管紧张素Ⅱ 商店冻干血管紧张素Ⅱ小瓶在-20℃。开幕前平衡血管紧张素Ⅱ小瓶RT。 称重所计算的AngII质量（7.3如表 1所示毫克）到无菌塑料管。 注：每默克索引，不使用玻璃试管进行溶解，因为血管紧张素Ⅱ的水溶液具有用于结合到玻璃有很强的亲和力。 添加无菌盐水的计算的体积（1200μ升）放入塑料管含有冻干的AngII，帽，并通过倒置调匀直到溶液澄清。 标签鼠标号＃1，＃2，＃3，和＃4上个别无菌塑料试管与盖（0.5 – 1.5毫升）。作为计算在步骤1.2中和表1中准备下一个层流罩基于体重各小鼠的AngII溶液。 例如，吸管3.6微升无菌盐水到管＃1中，然后296.4微升血管紧张素Ⅱ溶液，并通过上下抽吸轻轻混匀。 在塑料管与瓶盖标签鼠标数字（4毫升，无菌）。这些将被用于如步骤3.13中所述孵育泵。 3.渗透泵灌装泵的主体和流动调节剂（图1）：在两个独立的部分获得泵。每个包厢有10泵体和流量主持人被独立包装。记录批号。 注：始终穿手套，因为从手中转移到泵的外部套管油将产生不利泵血功能的影响。使用无菌手套，纱布，管，填充针，并称量皿制备的泵，避免从植入物感染的危险。 打开所需的研究泵体和流量主持人只有数字，因为这些不能被存储一旦打开。如果需要超过10个水泵，保证了泵的批号是相同的一项研究显示，由于来自不同批号泵具有不同的平均灌装量和泵速。 称量每个泵（包括本体和流动调节剂），并注意重量到4位小数（例如，1.1443克小鼠＃1）。这个重量，模板（表1）在被称为“泵空重”，将被用于计算填充比率。 附加泵填充针到1毫升无菌注射器，并仔细填充从适当的AngII溶液注射器编号的塑料管。以避免空气吸入注射器是非常重要的。 从注射器仔细除去所有的气泡，而针的方向为向下。保持针头/注射器在这个位置上，以防止引入气泡进入泵内。 轻轻插入填充针进入泵体。推进针的尖端进入泵。不休息的针的尖端紧紧在泵的底部。 推注射器推杆慢慢填充血管紧张素Ⅱ溶液泵。一个黑影泵内指示填充水平。灌装量大约是246微升，每说明。 停止填充泵，并仔细尽快取出针作为流体的珠升起泵。 通过对泵本体的顶部的孔插入流量调节剂进入泵，直到没有间隙看到的流动调节剂的头部和泵本体的顶部（图1）之间。 moderat的插入或进入泵体内导致从流动调节剂的开口一些流体泄漏。仔细涂抹，可能主持人置入过程中已经泄漏的所有额外的液体。 称量充填泵。记录下的重量在模板中“泵重填充”。 计算充填率（％）=（泵重“装” – “空”）×1000 /平均补量×100。 计算填充比如表1所示理想的情况下，填充比应等于或大于100％。再填充泵，如果填充率<95％（牵连气泡可能存在于泵）。 将填充泵入标记为4毫升管（步骤2.5）与主持人头部朝上。添加无菌盐水的足够体积，以覆盖泵。保持泵的盐水管，直到植入。 将管在37ºC孵化器。孵育泵O / N（至少12小时），以允许部分启动，然后植入到小鼠。泵ING血管紧张素Ⅱ的开始植入后约24小时，这使得小鼠从手术之前，期间输液血管紧张素Ⅱ所引起的任何潜在的压力中恢复。 4.准备泵植入高压灭菌器（重力模式，干燥周期，15分钟）的纱布，棉签和手术工具，包括剪，止血钳，镊子，订书钉，订书机和至少1天在手术前。 在操作室，准备蒸发器使用异氟烷麻醉。打开无菌单在层流罩，然后将鼻锥异氟醚麻醉。放置优碘，70％的乙醇，无菌水，珠灭菌，杀菌擦手，拭子，纱布，并填充泵在层流罩。 唐口罩和礼服，然后在层流罩用干净的手打开外悬垂性。戴上无菌手套，打开无菌内包。 泵植入5.手术过程鼠标放置在感应湛BER与异氟烷以1.5的流速流入 – 2％。监测小鼠另外2 – 斜卧后3分钟。剃须面积约四分之一的大小，在左边或右边肩膀。 放置鼠标在层流罩，用它的鼻子平齐与连接到异氟烷流出（图2A）的锥体。将鼠标的头部朝着外科医生的惯用手。使用鼠标的眼睛兽医药膏，以防止干燥，而在麻醉下。确保鼠标有之前手术的疼痛刺激无反应。例如，踏板响应是对于疼痛的良好指标。 拭子并用优碘接着是三个擦拭物用70％乙醇擦拭剃的区域。唐或更改无菌手套。 使用手术刀，使耳朵上前腿的肩胛骨背后〜1厘米的切口。这个切口应垂直于尾部。请小心，只切开皮肤，而不是深层组织。 保持FORC在一方面EPS以打开切口，并用另一只手使用止血钳（图2B）在皮肤下一个皮下隧道。 推进止血钳尖端朝向尾部，并创建一个口袋泵。这是通过小心地打开止血钳钳夹皮肤下开辟一个袋子来完成。退出切口止血。 插入泵入切口与所述主持头定位到小鼠（图2C）的后部。轻轻泵完全推入口袋。应该有足够的自由空间，以无张力或拉伸皮肤的闭合伤口。 一旦泵已经插入，紧紧捏住切口的两侧，矫直所以边缘会合处，并放置1或2个伤口夹关闭（图2D）。检查切口部位，以确保有伤口完全闭合，并且该泵被直接在网站上不加压。 局部应用利多卡因乳膏（4％重量/重量），用干净的棉布swab.Remove鼠标从鼻锥，并将其放置在一个加热垫，直到它恢复意识。回收后，将小鼠返回其笼中。 放置手术器械成珠灭菌对小鼠之间10秒。允许仪器使用前冷却。干净的手套与小鼠之间防腐剂擦手。监视所有小鼠，直到完全恢复为止。 手术后密切监测小鼠。注射无菌盐水的大丸剂（0.2 – 0.3毫升）皮下如果小鼠显示窘迫，脱水或表观重量损失的迹象。每天至少一次随后在第10天观察小鼠每天至少两次，和。立即执行尸检如果在血管紧张素Ⅱ输液任何小鼠死亡。手术后14天 – 在7取出伤口剪辑。 6.收集，固定，清洗和主动脉的成像切腹侧鼠标打开胸腔和腹腔，切开OPEn右心房，灌注生理盐水通过心脏的左心室清除血液中的主动脉，然后收获主动脉27。 将塑料管含24至少3毫升4％多聚甲醛和10％的中性缓冲福尔马林的收获主动脉- 48小时27。 小心取出外膜组织。销主动脉黑蜡引脚。获取主动脉图像相同的放大倍率。包括在每一个图像用于校准的标尺， 如图3。 主动脉7.恩面对成像通过主动脉弓的外和内曲率切开主动脉纵向，并切开主要分支包括无名，左颈动脉和左锁骨下动脉。引脚主动脉持平外外膜铺设毗邻黑蜡。 获得带连接主动脉的内膜表面在相同的放大倍数脸图像。包括在每个图像校准一把尺子，作为表演中的n 图4。