막 효소 용매 역학에 의해 유도 탈피 엔트 속도 가속

(1)에 실리 컴퓨터 모델링 단백질 데이터 은행 (PDB)에서 관심의 단백질의 PDB 구조를 다운로드합니다. 과량의 서브 유닛을 분리 한 후 "셀 중화 및 P K 예측"YASARA 16의 실험을 사용하여 누락 된 수소 원자는 명시하고 용매를 첨가함으로써 구조체를 준비한다. 막 결합 된 트리 테르펜 cyclases 들어, 워터 박스의 적합한 사이즈 91x67x77 Å이다. 수동으로 촉매 활성 아미노산의 양성자 상태를 조정합니다. 참고 : PDB 파일의 기판 아날로그 "편집 | 교환 | 아톰"을 사용하여 실제 기판에 수정 될 수 있습니다 필요한 경우 명령을. 황색 포스 필드 스위트 (17)를 사용하여 "에너지 최소화"명령에 의해 구조를 최소화합니다. 장거리 정전 기적 ​​상호 작용을 고려하여 입자 메시에 발트 방식 (PME) (18)를 사용합니다. 따라서 반 데르 발스 상호 작용에 대한 차단을 설정표준 설정. 주 : 수렴에 도달 할 때까지 "에너지 최소화"명령 다음 짧은 최대 경사 최소화, 시뮬레이트 어닐링에 의해 구조적 응력 제거 (시간 단계 2 FSEC 0.9 매 10 번째 단계에서 축소 원자 속도)이 수행된다 (즉, 에너지의 향상 ) (200) 단계에서 원자 미만 0.012 킬로 칼로리 / 몰. 활성 부위 매화와 물 접근 2. 모델 모의 어닐링 후, 20 NSEC 분자 역학 (MD) 궤도를 실행하고 "파일 | 저장 | 시뮬레이션 스냅 샷"적어도 10 스냅 샷을 생성 "시뮬레이션"다음 명령을 실행합니다. 정규 앙상블에서주기적인 경계 조건으로 표준 컴퓨터 시뮬레이션을 실행합니다. Berendsen의 온도 조절기를 사용하여 298 K의 온도를 유지한다. 모든 물 분자와 최종 리간드 / 기판을 사용하여 삭제하여 2.1에서 얻은 스냅 샷을 준비4; 수정 | 삭제 | 중첩 잔류 "에 의해 원래의 PDB 구조에 개별적으로 명령 중첩 각각의 스냅 샷."| 개체 "명령은 모든 구조가 동일한 공간 위치를 공유 할 수 있도록 새로운 PDB로이 방법으로 제조 된 각각의 스냅 샷을 저장합니다. – 파일 (사용 "파일 | 다른 이름으로 저장 | PDB"명령). 경험 모델러의 경우 : 참고 : 보조 코드 파일 1에 주어진 템플릿에 따라이 프로세스를 자동화하는 스크립트를 작성합니다. 소프트웨어 동굴 탐험가 3.0 (19)에 입력으로 3D 공간에 정렬 된 2.2에서 준비된 스냅 샷 (PDB)를 사용합니다. 스냅 샷의 제한된 수의 분석을 위해, 표준 컴퓨터를 실행 동굴 탐험가. 물 분자의 수송에 특이 터널의 검출을 보장하기 위해 0.7 Å (19)의 반경 프로브를 사용한다. 분자 그래픽 소프트웨어에 의해 생성 된 동굴 탐험가 3.0 터널을 시각화. 터널의 쉬운 시각화를위한, 보충 코드 필에 표시된 매크로를 사용전자 2. 실리 효소 공학 3. 물 패턴 및 물 역학을 수정하는 방법 동굴 탐험가 3.0 소프트웨어에서 생성 된 출력 파일 "있는 Summary.txt"에 나열된 헤더 "ID"에 따라 가장 높은 순위 터널을 식별합니다. 가장 높은 순위 터널 (3.1)과 그 디스플레이 (2.4에서 얻은 모델을 사용) 육안 검사로 채널 내부를 가리키는 작은 사이드 체인을 감 아미노산을 확인합니다. "스왑 잔류"명령을 사용하여 증가 입체 장애에 의한 터널을 차단 하나의 아미노산 치환을 확인합니다. 터널이 단계 프로토콜의 1.2-3.1를 반복하여 다음 육안 검사에 의해 차단되고 있는지 확인합니다. 변이 유전자의 4 식 겹치지 20 프라이머를 사용하여 PCR 돌연변이 유발 야생형 유전자에 돌연변이를 도입. 튜브 관심 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 추가적합한 클로닝 균주의 적격 세포와의 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 42 ° C로 설정 온도와 수조에서 45 초 동안 열 쇼크 형질 전환을 수행한다. 신선한 풍부한 매체의 500 μl를 추가 (2YT는, 16g / L의 트립 톤, 10g / L 효모 추출물, 5g / L의 NaCl)과는 37 ° C에서 부화, 45 분 동안 200 rpm으로. 적절한 항생제로 보충 한천 접시에 형질 전환 된 세포를 도금을 선택합니다. 돌연변이 유전자의 DNA 서열을 확인한 후, 전술 한 바와 같이 열 쇼크를 사용하는 발현 균주에 플라스미드 DNA를 변형. 막 결합 트리 테르펜 cyclases의 발현을 위해, BL21 (DE3)를 사용합니다. 적절한 항생제로 보충 2YT 미디어에서 발현 균주의 37 ℃에서 5 ML의 O / N 문화를 시작합니다. 0.05-0.09의 최종 OD에, 적절한 항생제로 보충 300 ml의 2YT 미디어를 포함, 2 L 당황 쉐이크 플라스크에 접종 (600 nm에서 측정). 0.6-0의 외경에서 유도 한 후.도 8 및 단백질 발현, -80 ° C에서 세포 펠렛을 동결 및 저장. pD861 벡터에 막 결합 트리 테르펜 cyclases 들면, 단백질 (21)의 높은 수율을 달성하기 위해, 37 ℃에서 0.5 mM의 발현 시간이 람 노스 2 및 4로 유도한다. 일반 원심 분리기 및 단백질 정제를 사용하여 5 막 추출 다음의 버퍼를 준비한다 재현 탁 완충액 (100 mM의 인산 칼륨을, 프로테아제 억제제 정제로 보충 된 pH를 7.5), 세제 완충액 (1 % (v / v) 트리톤 X-100, 50 mM의 인산 칼륨, pH를 7.5) 및 반응 완충액 (0.2 % 트리톤 X-100, 50 mM의 인산 칼륨, pH를 7.5). 스쿠알렌 hopene의 cyclases 또는 낮은 pH 최적 다른 막 결합 효소, 시트르산 완충액에 재현 탁 인산 칼륨을 대체. 세제 완충액 (1 % 트리톤 X-100 : 효소에 대해 다음 버퍼를 사용60 mM의 시트 레이트, 산도 6.0)과 반응 버퍼 (0.2 % 트리톤-X 100, 60 mM의 시트 레이트, pH를 6.0). 주의 : 그 태그는 정제를 위해 사용되는 경우, 20 mM의 이미 다졸 (최종 농도)로 재현 탁 버퍼를 보충. 유리 비커에서 냉동 된 세포 펠렛의 무게. / ㎖ 0.3 g 세포의 최종 농도로 재현 탁하여 균질화 완충액에 세포를 재현 탁. 80 %의 진폭에 1 초 1 초 오프 펄스 초음파로를 Lyse은 재현 탁 세포. 50 초 각의 세 가지 반복주기를 사용합니다. 0.2 % (v / v)의 세제의 최종 농도 세제 버퍼를 추가한다. 1 시간 동안 4 ℃에서 혼합 엔드 오버 엔드에 의해 평형. 4 ° C에서 50 분 동안 39,000 XG에 하나의 원심 분리 단계 후에 뜨는을 저장하여 막 단백질 부분을 복구 할 수 있습니다. 참고 : 그의 태그 정제를 사용하는 경우, 아가로 오스 / g 세포를 1.5 ml의 니켈 NTA를 추가로 1 시간 동안 배양한다. 첫 번째 정화를 수행이온 교환 또는 그의 태그 정화 (21) 중 하나에 의해 단계. 0.2 % 트리톤 X-100 평형 및 용출 버퍼를 보충합니다. 정제 된 단백질 10 kDa의의 차단과 원심 필터 유닛을 사용하여 다섯 번 집중. 주 : 세제 농도 트리톤 X-100 미셀 결과의 크기를 약 1 %의 최종 농도. . (2) 106 × 10 × 4 -8의 구상 단백질 분획 범위와 호환 농축 단백질 및 매트릭스를 사용하는 겔 여과에 의해 정제 연마 공정을 마무리 버퍼를 실행하는 것과 반응 완충액을 사용한다. 제조사의 프로토콜에 따라 브래드 울트라 키트를 사용하여 정제 된 단백질의 양을 측정한다. 6. 속도론 반응 버퍼에 기판의 신선한 5 밀리미터 주식 솔루션을 확인하십시오. 2-5 분 동안 30 %의 진폭에 초음파에 의한 균일 한 에멀젼을 얻습니다. 써모 평형원하는 반응 온도. 외부 온도계로 유리 바이알 함유 물 내부의 온도를 확인한다. 단일 기판 속도론을 위해, 동일한 최종 기질 농도에 적어도 다섯 유리 바이알에 유화 기판 희석. 여러 기판 한 냄비 상대적으로 반응 속도, 각 유리 병에있는 모든 기판을 혼합하여 적어도 5 개의 동일한 유리 병을 준비합니다. 소수성 트리 테르펜를 들어, 10 내지 200 μM의 범위의 최종 기질 농도를 사용한다. 10 분 동안 써모 유리 바이알을 Preinc​​ubate. 효소를 첨가하여 반응을 개시. 1 ml의 총 반응 부피가 적합하다. 적어도 1,200 rpm의 진동 속도를 사용합니다. 500 ㎕의 에틸 아세테이트를 첨가하여 서로 다른 시점에서 반응을 정지 통합 표준 100 μM의 데칸으로 스파이크. 7. 추출 및 열역학적 분석 에 의해 반응 혼합물을 추출텍싱 수동으로 1 분 동안 격렬하게 유리 병을 흔들어. 실온에서 10 분 동안 테이블 상단 원심 분리기에서 9,600 XG에 유리 튜브를 원심 분리기. 빈 튜브 상단 층 (유기상)를 전송합니다. 반응 튜브에 추출 용매의 추가의 500 μl를 첨가하고 추출 과정을 반복한다. 나 2 SO 4와 추출 된 반응 혼합물을 건조. 5 초 동안 소용돌이 및 튜브 10 분 동안 휴식을 할 수 있습니다. 테이블 탑 원심 분리기를 사용하여 실온에서 1 분 동안 9,600 XG에서 최종 원심 분리 단계를 수행합니다. 가스 크로마토 그래피 (GC) 바이알로 추출한 샘플을 전송. (단일 기판 역학에 대한) 기판의 적어도 네 가지 초기 농도 (단일 기판과 경쟁력 역학 모두) 네 개의 서로 다른 온도를 사용하여, 관심있는 각각의 효소 변형에 대한 6.1-7.2 아래의 단계를 반복합니다. 이전에 3 설명한 바와 같이 GC 분석을 수행합니다. hydrophob의 분석 비극성 열을 사용IC 펜타 제품. 제품 및 열에 따라, 120 ℃로 오븐 초기 온도를 5 ℃ / 분의 온도 구배를 사용한다. 생성물 (들)의 피크 면적을 통합하여 (100 μM에 상당)의 통합 표준의 영역을 이용하여 해당 제품 농도 제품에 피크 면적을 변화. 반응 시간 (t) 대 각 제품 ([P])의 농도를 플롯. 10 % 미만의 전환에 대응하는 데이터 포인트의 선형 회귀 분석을 수행한다. 초기 반응 속도 (0 V)에 따라 장착 직선의 기울기에 의해 주어진다 : 참고 : 여러 개의 기판을 하나의 냄비 상대적으로 반응 속도를 들어, V 0는 다른 기판의 영향으로 특정 기판의 초기 속도입니다. 단일 기판 속도론, 플롯 V 0 </su해당 기질 농도에 대한 B> / [E]. 겉보기 K 고양이 / K M 값에 따라 그래프의 직선 부분의 기울기에 의해 주어진다 : [S]는 기질과의 농도는 [E] 변태. K 고양이에 사용되는 효소의 농도 / K M은 미카엘 상수 위에 촉매 상수 동일시. 각각의 온도와 각 효소 변형에 대한 분석을 반복합니다. 단일 기판 속도론 들어, 전이 상태 (22)의 이론에 따라 열역학적 분석을 수행 K B는 볼츠만 상수, H 플랑크 상수, T 켈빈 온도이며, 기체 상수를 R. K ((LN의 플롯의 선형 회귀 분석을 수행 <sUB> 고양이 / K M) / ((K B 형 *의 T) / H))) 1 / T 대. 활성화 엔탈피 (Δ H ‡) (-slope가) * R 및 활성화 엔트로피 (Δ S ‡)을 (차단) * R에 의해 주어진다에 의해 주어진다. 주 : 마찬가지로, 포화 기질 농도 하에서 분석 수학 식 3에서 일정한 속도로 K 고양이를 사용하여 수행 될 수있다. 복수의 기판을 하나의 냄비 상대 동력학 들어 상대적인 겉보기을 구하는 K 고양이 / 23에서 K M 값 : (K 고양이 / K M) / (K 고양이 / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4) 이는 V 0,는 기판과 경쟁 B. 기판에 대한 초기 레이트를 의미 한 냄비 상대 기의 경우다수의 기판과 동력학은 비선형 회귀 분석에 의해, 같은 기준에 비해, B의 활성화의 상대적 열역학적 파라미터를 구하십시오 활성화 엔탈피 및 참조 화합물의 엔트로피로부터 기판 B에 대한 절대 기동 파라미터를 계산 :