단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염
Summary
The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.
Abstract
그 인간 숙주를 입력, 단순 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 점막 표면, 피부 또는 각막의 장벽을 극복해야한다. HSV-1 대상은 초기 진입시 각화 및 신경 세포의 잠재 감염 뒤에 상피에 차 감염을 설정합니다. 재 활성화 한 후, 바이러스는 피부 소포 또는 점막 궤양으로 표시 피부 점막 부위에서 분명하게 할 수 있습니다. HSV-1은 피부 나 점막을 침범하고 도달 방법의 수용체는 제대로 이해된다. 세포 수준에서 표피 조직에 HSV-1의 침입 경로를 조사하기 위해, 우리는 피부의 기본 및 재발 성 감염 부위를 나타내는 쥐의 표피의 생체 감염 모델을 설립했다. 분석은 쥐의 피부의 준비를 포함한다. 표피는 디스 파제 II 처리하여 진피로부터 분리된다. 바이러스 – 함유 배지에서 상피 시트를 플로팅 한 후, 조직은 고정이고 감염에 의해 여러 번 postinfection에서 시각화 될 수있는HSV-1 즉각적인 초기 ICP0 단백질에 대한 항체로 감염된 세포를 염색. ICP0는 발현 세포 것은 1.5 열연 postinfection 이미 기저 각질 세포 층에서 관찰 될 수있다. 더 이상 감염 시간으로, 감염된 세포는 감염이 기초 각질 세포로 제한하지만, 바이러스가 조직에서 다른 층으로 확산되어 있지 않은 것을 나타내는, suprabasal 층에서 발견된다. 다양한 마우스 모델의 표피 시트를 사용하면, 감염 프로토콜은 조직으로 HSV-1 침입에 기여 세포 성분의 참여를 결정하는 허용한다. 또한, 분석은 초기 진입 단계에 지장 조직 억제제, 세포 간 확산 및 바이러스 생산을 테스트하기에 적합하다. 여기, 우리는 세부 사항에 생체 감염 프로토콜을 설명하고 nectin-1 또는 HVEM 결핍 마우스를 사용하여 우리의 결과를 제시한다.
Introduction
단순 포진 바이러스 (HSV)는 생명을 위협하는 감염에 약한 단순한 피부 점막 병변에서 인간의 질병의 범위가 발생할 수 있습니다. HSV 1 형 (HSV-1)이 지배적 가능성 생식기 감염 1 원인 HSV 2 형 (HSV-2), 반면, 구강 안면 뇌염 감염과 관련된다. HSV는, 문화에서 셀을 입력 감염을 시작하고 바이러스 자손을 생산하는 방법의 이해에 상당한 진전이있는 동안, 우리는 세포 수준 2에서 조직에 바이러스 침입 경로 (들)에 대해 거의 알고있다. HSV 피부 또는 점막 감염 마우스의 연구를 들어, 토끼, 기니아 피그 동물 모델로서 사용되어왔다. 피부 감염은 피내 주사 또는 바이러스의 존재에 의해 피부를 긁 확립시키고, 질병 발달은 바이러스 생산과 관련이 있었다. 이러한 방법은 질병 발병의 다양한 측면을 이해하는 데 도움이, 그리고 항 바이러스 약물을 평가하는 데 사용됩니다. tissu에서 HSV 감염을 연구하는E 수준은, 인간의 피부의 Organotypic 모델이 적용되어왔다. 감염률은 이들 뗏목 배양 제한되는 바와 같이, 감염, 바이러스 확산을 조사하는 연구와 항 바이러스 성분의 효과의 제한된 수는 3-6 발표되었다.
그대로 상피에서 HSV-1 감염 기간 동안 역할을 휴대 결정기를 특성화하기 위해, 우리는 뮤린 표피 (7)의 생체 감염 연구를위한 프로토콜을 확립. 신생아 피부 또는 성체 마우스의 꼬리로부터 제조 하였다. HSV-1 바이러스 함유 배지에서 침수 된 완벽한 피부 샘플을, 감염 없었기 때문에, 우리는 디스 파제 II 처리에 의해 진피에서 표피를 분리. 바이러스 – 함유 배지에서 표피 시트 부동 후 감염된 세포를 다양한 시간의 postinfection (PI) (7)에서 기저 표피 층으로 시각화 될 수있다. 바이러스 복제에 앞서 각 셀 감염의 개시를 시각화ND 바이러스 생산, 우리는 HSV-1 감염 기간 동안 발현되는 첫 단백질이다 감염된 세포 단백질 0 (ICP0)에 대한 항체로 염색. ICP0의 세포 현지화는 초기 감염시 가지 단계를 통과한다. ICP0는 바이러스 유전자 발현의 초기 단계에서의 핵 병소에 존재하지만, 세포질로의 ICP0 relocalization 감염 (8)의 후속 단계를 나타낸다.
우리는 감염 동안 다양한 세포 인자의 역할 가능성을 테스트하기 위해 다른 마우스 모델에서 상피 시트의 생체 감염 분석을 사용 하였다. 굴지 역학의 핵심 레귤레이터로 RAC1의 영향을 해결하기 위해, 우리는 RAC1 유전자 (9)의 각질 세포 고유의 삭제와 쥐의 표피를 감염. 이 모델은 표피의 각질 층에서 HSV-1 감염의 효율성에 결함이 RAC1의 결과를 연구하기 위해 우리를 허용했다. 다시 제어 한배 새끼의 감염 표피에 비교RAC1의 부재 (7)의 표피 기저층 감염의 개시에 아무런 영향을 미치지 않았다 나타내는 큰 차이를 vealed 없다. 상기 마우스 모델의 사용은 우리가 세포 수용체는 표피 진입을 중재 할 수있는 해결. HSV-1 nectin -1- HVEM 또는 – 결핍 마우스에서 표피 중 시트 감염은 조직으로 진입 초기 바이러스 강하게 nectin-1 (10)의 존재에 의존한다는 것을 밝혔다. 또한, 우리의 결과는 HVEM 또한 nectin-1 (10)보다 덜 효율적 있지만, 쥐의 표피에있는 수용체 역할을 할 수 있음을 보여줍니다.
표피 층에 감염된 세포의 공간 분포를 해결하기 위해, 우리는 조직 절편, 표피 및 전체 마운트 (도 1)의 발현을 ICP0 시각화. 전체 피부의 저온부에서 더 ICP0 발현 세포는 (그림 1) 검출되지 않습니다. 대조적으로, 상피 시트의 저온부가 세포질을 보여이미 3 시간 PI (그림 1)에서 기저층에서 ICP0 식입니다. 나중에 시간에, 바이러스가 가시화 될 수있다 층을 suprabasal 확산. 기저층에 감염된 세포의 공간 분포를 용이하게 표피 전체 마운트 (도 1)에 따라 될 수있다. HSV-1 100 PFU / 셀에 감염되면, interfollicular 표피의 기저 각질 세포의 약 50 %는 대부분의 감염된 세포 핵 ICP0을 표현하는이 시점에서 1.5 시간 파이에서 ICP0 식을 보여줍니다. 초기 유전자 발현의 후기 단계를 나타내는 세포질 ICP0의 relocalization 3 열연 PI (도 1)의 거의 모든 세포에 존재한다. 생체 HSV-1 감염에 감염된 세포를 시각화의이 모드는 억제제 또는 조직에서 바이러스 성 항목 및 확산에 / 삭제 돌연변이 세포 성분의 효과를 연구 할 수있는 강력한 분석을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
When epidermal sheets of adult skin from C57BL/6 are infected with HSV-1 at approximately 100 PFU/cell, we observe infection in nearly all cells of the basal layer in the interfollicular epidermis while lower virus doses correlate with less infected cells and a slower progress of infection. In general, hair follicles show a variable number of infected cells; while most of the rather small keratinocytes lining the developing hair follicles are infected, only the hair germ of the adult hair follicle is completely infected….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Peter Staeheli for providing B6.A2G-Mx1 mice and Semra Özcelik for technical advice.
This work was supported by the German Research Foundation through SFB829 and KN536/16, and the Köln Fortune Program/Faculty of Medicine, University of Cologne.
Materials
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
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