दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 के साथ Murine एपिडर्मिस के पूर्व vivo संक्रमण
Summary
The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.
Abstract
अपने मानव मेजबान प्रवेश करने के लिए, दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 (एचएसवी -1) श्लैष्मिक सतहों, त्वचा, या कॉर्निया की बाधा को दूर करना होगा। एचएसवी -1 लक्ष्यों प्रारंभिक प्रवेश के दौरान केरेटिनकोशिकाओं और न्यूरॉन्स की अव्यक्त संक्रमण द्वारा पीछा किया जाता है, जो उपकला में एक प्राथमिक संक्रमण स्थापित करता है। पुनर्सक्रियन के बाद, वायरस त्वचा पुटिकाओं या श्लैष्मिक अल्सर के रूप में दिखाई देते हैं कि mucocutaneous स्थलों पर स्पष्ट हो सकता है। एचएसवी -1 त्वचा या म्यूकोसा पर हमला और पहुँचता है कैसे अपने रिसेप्टर्स खराब समझा जाता है। सेलुलर स्तर पर एपिडर्मल ऊतक में एचएसवी -1 के आक्रमण के मार्ग की जांच करने के लिए, हम त्वचा में प्राथमिक और आवर्तक संक्रमण की साइट का प्रतिनिधित्व करता है जो murine एपिडर्मिस के एक पूर्व vivo संक्रमण मॉडल की स्थापना की। परख murine त्वचा की तैयारी भी शामिल है। एपिडर्मिस Dispase द्वितीय उपचार द्वारा डर्मिस से अलग किया जाता है। वायरस युक्त मध्यम पर एपिडर्मल शीट चल के बाद, ऊतक ठीक हो गई है और संक्रमण के विभिन्न समय postinfection पर देखे जा सकते हैंएचएसवी -1 तत्काल जल्दी प्रोटीन ICP0 के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ संक्रमित कोशिकाओं धुंधला हो जाना। ICP0 व्यक्त कोशिकाओं 1.5 घंटे postinfection पर पहले से ही बेसल keratinocyte परत में मनाया जा सकता है। अब संक्रमण समय के साथ, संक्रमित कोशिकाओं के संक्रमण बेसल केरेटिनकोशिकाओं तक ही सीमित है, लेकिन वायरस के ऊतकों में अन्य परतों को फैलाता नहीं है, यह दर्शाता है suprabasal परतों में पता चला रहे हैं। विभिन्न माउस मॉडल की एपिडर्मल शीट का उपयोग करना, संक्रमण प्रोटोकॉल के ऊतकों में एचएसवी -1 आक्रमण करने के लिए योगदान है कि सेलुलर घटकों की भागीदारी का निर्धारण करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, परख प्रारंभिक प्रवेश कदम के साथ हस्तक्षेप है कि ऊतक में अवरोधकों, सेल करने वाली सेल प्रसार और वायरस के उत्पादन के परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है। यहाँ, हम विस्तार में पूर्व vivo संक्रमण प्रोटोकॉल का वर्णन है और nectin-1- या HVEM की कमी चूहों का उपयोग हमारे परिणाम प्रस्तुत करते हैं।
Introduction
हरपीज सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी) जीवन के लिए खतरा संक्रमण के लिए हल्के सीधी mucocutaneous घावों से मानव में रोगों की एक सीमा का कारण बन सकता है। एचएसवी टाइप 1 (एचएसवी -1) मुख्यतः अधिक होने की संभावना यौन संक्रमण का कारण बनता है 1 एचएसवी टाइप 2 (एचएसवी -2), जबकि orofacial संक्रमण और इन्सेफेलाइटिस के साथ जुड़ा हुआ है। एचएसवी, संस्कृति में कोशिकाओं में प्रवेश करती संक्रमण शुरू की और वायरल संतान पैदा करता है कि कैसे समझ में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है, वहीं हम सेलुलर स्तर 2 में ऊतकों में वायरल आक्रमण मार्ग (एस) के बारे में बहुत कम जानते हैं। एचएसवी त्वचा या श्लैष्मिक संक्रमण, चूहों की पढ़ाई के लिए, खरगोश और गिनी सूअरों पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। त्वचा संक्रमण अंतर्त्वचीय इंजेक्शन द्वारा या वायरस की उपस्थिति में त्वचा scratching द्वारा स्थापित किया गया था, और रोग विकास वायरस उत्पादन के साथ सहसंबद्ध था। इन विधियों रोग रोगजनन के विभिन्न पहलुओं को समझने में मदद की है, और एंटीवायरल दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Tissu पर एचएसवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिएई स्तर, organotypic मानव त्वचा मॉडल लागू किया गया है। संक्रमण की दर इन बेड़ा संस्कृतियों में प्रतिबंधित है के रूप में, संक्रमण, वायरल प्रसार की जांच के अध्ययन और एंटीवायरल घटकों के प्रभाव का केवल एक सीमित संख्या 3-6 प्रकाशित किया गया है।
बरकरार उपकला में एचएसवी -1 संक्रमण के दौरान एक भूमिका निभाते हैं कि सेलुलर निर्धारकों को चिह्नित करने के लिए, हम murine एपिडर्मिस 7 के पूर्व vivo संक्रमण के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की। त्वचा नवजात शिशुओं से या वयस्क चूहों की पूंछ से तैयार किया गया था। एचएसवी -1 वायरस युक्त मध्यम में डूबे हुए थे, जो पूरी त्वचा के नमूने, संक्रमित नहीं कर सका, हम Dispase द्वितीय उपचार द्वारा डर्मिस से एपिडर्मिस अलग कर दिया। वायरस युक्त मध्यम पर एपिडर्मल चादरों की अस्थायी बाद, संक्रमित कोशिकाओं विभिन्न समय postinfection (पीआई) 7 पर एपिडर्मल बेसल परत में देखे जा सकते हैं। वायरल प्रतिकृति एक करने से पहले व्यक्ति की कोशिकाओं में संक्रमण की दीक्षा कल्पना करने के लिएएन डी वायरस उत्पादन, हम एचएसवी -1 संक्रमण के दौरान व्यक्त की पहली प्रोटीन में से एक है जो संक्रमित कोशिका प्रोटीन 0 (ICP0), के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ दाग। ICP0 के सेलुलर स्थानीयकरण जल्दी संक्रमण के दौरान अलग चरणों से होकर गुजरता है। ICP0 वायरल जीन अभिव्यक्ति का एक प्रारंभिक चरण के दौरान परमाणु foci में मौजूद है, वहीं कोशिका द्रव्य को ICP0 की पुनर्स्थानीकरण संक्रमण 8 के बाद में एक चरण में इंगित करता है।
हम संक्रमण के दौरान विभिन्न सेलुलर कारकों की संभावित भूमिका का परीक्षण करने के लिए विभिन्न माउस मॉडल से एपिडर्मल चादरों की पूर्व vivo संक्रमण परख के लिए इस्तेमाल किया। Actin गतिशीलता का एक प्रमुख नियामक के रूप में Rac1 के प्रभाव को संबोधित करने के लिए, हम Rac1 9 जीन की एक keratinocyte विशेष विलोपन के साथ चूहों के एपिडर्मिस संक्रमित। यह मॉडल एपिडर्मल keratinocyte परतों में एचएसवी -1 संक्रमण की दक्षता पर कमी Rac1 के परिणामों का अध्ययन करने की अनुमति दी। फिर से नियंत्रण littermates के संक्रमित एपिडर्मिस की तुलनाRac1 के अभाव एपिडर्मिस 7 के बेसल परत में संक्रमण की दीक्षा पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा यह दर्शाता है कि कोई महत्वपूर्ण अंतर vealed। आगे माउस मॉडल का उपयोग हमें सेलुलर रिसेप्टर्स एपिडर्मिस में प्रवेश के लिए मध्यस्थता जो को संबोधित करने की अनुमति दी। एचएसवी -1 के साथ nectin-1- या HVEM की कमी चूहों से या तो एपिडर्मल चादरों को संक्रमित ऊतक में प्रारंभिक वायरल प्रविष्टि जोरदार nectin-1 से 10 की उपस्थिति पर निर्भर करता है कि पता चला। इसके अलावा, हमारे परिणाम HVEM भी nectin-1 10 से कम कुशलता हालांकि, murine एपिडर्मिस में रिसेप्टर के रूप में सेवा कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है।
एपिडर्मल परतों में संक्रमित कोशिकाओं के स्थानिक वितरण को संबोधित करने के लिए, हम ऊतक वर्गों और एपिडर्मल पूरे mounts (चित्रा 1) में ICP0 अभिव्यक्ति कल्पना। पूरी त्वचा की cryosections में, कोई ICP0 व्यक्त कोशिकाओं (चित्रा 1) का पता चला रहे हैं। इसके विपरीत, एपिडर्मल चादरों की cryosections साइटोप्लास्मिक प्रदर्शितपहले से ही 3 घंटे गड़बड़ी (चित्रा 1) में बेसल परत में ICP0 अभिव्यक्ति। बाद में कई बार, वायरल देखे जा सकते हैं परतों suprabasal को फैलने। बेसल परत में संक्रमित कोशिकाओं के स्थानिक वितरण आसानी से एपिडर्मल पूरे mounts (चित्रा 1) में किया जा सकता है। एचएसवी -1 100 pfu / सेल में साथ संक्रमण पर, interfollicular एपिडर्मिस में बेसल केरेटिनकोशिकाओं का लगभग 50% सबसे संक्रमित कोशिकाओं परमाणु ICP0 का इजहार इस समय बिंदु पर 1.5 घंटे गड़बड़ी पर ICP0 अभिव्यक्ति दिखा। जल्दी जीन अभिव्यक्ति के बाद के चरण का संकेत कोशिका द्रव्य को ICP0 की पुनर्स्थानीकरण 3 घंटा गड़बड़ी (चित्रा 1) में लगभग सभी कोशिकाओं में मौजूद है। पूर्व vivo एचएसवी -1 संक्रमण पर संक्रमित कोशिकाओं visualizing के इन साधनों अवरोधकों की या ऊतक में वायरल प्रविष्टि और प्रसार पर / नष्ट कर दिया उत्परिवर्तित सेलुलर घटकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली परख प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वयस्क C57BL से त्वचा / 6 की एपिडर्मल शीट एचएसवी -1 से संक्रमित होते हैं जब कम वायरस खुराक सहसंबंधी, जबकि लगभग 100 pfu / सेल, हम कम संक्रमित कोशिकाओं और एक धीमी साथ interfollicular एपिडर्मिस में बेसल परत के लगभग सभी कोशिकाओं म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सलाह के लिए B6.A2G-MX1 चूहों और Semra OZCELIK प्रदान करने के लिए पीटर Staeheli धन्यवाद।
इस काम SFB829 और KN536 / 16 के माध्यम से जर्मन रिसर्च फाउंडेशन, और चिकित्सा के कोलोन फॉर्च्यून कार्यक्रम / संकाय, कोलोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
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