Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс

Иммунная толерантность во время беременности период, когда отличительные изменения происходят в иммунной системе матери. Эти изменения позволяют мать терпеть плод, полу-аллогенную трансплантата ^1. Плод выражает отцовской главного комплекса гистосовместимости (МНС) антигены ² и фетальные клетки были обнаружены в материнском кровотоке ^3; Однако, плод не отторгается ^4,5. Это загадка полностью не поняты.

Самая недавняя гипотеза утверждает, что толерантность материнского плода создается во время полового акта и оплодотворения ^6,7 и поддерживается выдержать полный срок беременности ^8-10. Разбивка этой материнской плода толерантности считается механизм заболевания на ранних и поздних стадиях беременности ^10-16. Допуск матери и плода включает в себя участие различных лейкоцитов групп населения, в том числе Т-клеток (регуляторных Т-клеток, клеток Th1, Th2 клеток, и клетки Th17), Macмакрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, NK-клетки, и НКТ-клеток, дендритные клетки, В-клетки и, что изменения в плотности и локализации во время беременности ^15,17-19. Допуск матери и плода обогащается на материнской плода интерфейс ²⁰ – анатомической месте, где иммунная система матери взаимодействует с антигенами плода ^20,21.

Интерфейс материнской плода создается во время плаценты, когда эмбриональные клетки трофобласта extravillous вторгнуться слизистой оболочки матки ^22-24. На стороне плода этого интерфейса, мембраны, окружающие плод создать специализированный эпителиальной поверхности в плаценте, и syncytiotrophoblast клетки контролировать обмен питательных веществ через их непосредственном контакте с материнской кровью ^22. По материнской стороне интерфейса, децидуальной набирает гетерогенную пул лейкоцитов у мышей, которые составляют 30% до 50% всех клеток плаценты. В дополнение к их участию в Матерналь иммунной толерантности, эти клетки являются главными участниками различных процессов во время беременности., например, защиты репродуктивного тракта от инфекций, оплодотворения, имплантации эмбриона ^7,25, децидуальный ангиогенез ^26, ремоделирование сосудов ^24,27, трофобласт вторжение ^28, плацентарный Развитие ^24,25, и, в итоге, труда и доставка ^15,17. Таким образом, изучение лейкоцитов, участвующих в толерантности материнской плода имеет важное значение для выяснения патогенеза осложнений, связанных с беременностью.

Хотя использование иммуногистохимии и иммунофлуоресценции породила данные для непосредственной визуализации и локализации матки, плаценты, или плацентарных лейкоцитов ^29,30, проточной цитометрии анализа показали еще более конкретные субтипов лейкоцитов в каждой из этих тканей ^31,32. Кроме того, проточной цитометрии был использован для определения плотности и часть оболочкинал плода интерфейс лейкоциты ³³ и уровни экспрессии внеклеточных и внутриклеточных белков ^8-10,34. Проточной цитометрии анализ лейкоцитов на границе материнской плода требует одного суспензии клеток. Для того, чтобы изолировать Лейкоциты проникают из децидуальной, матки, плаценты и тканей, были использованы два метода ткани диссоциации: механическая и ферментативная. Оба метода позволяют разделение проникших лейкоцитов из внеклеточного матрикса (ЕСМ) этих тканей. Ферментативный диссоциации ткани превосходит механической ткани диссоциации, так как позволяет более высокий выход лейкоцитов с менее сдвига силы ассоциированного повреждения ^35. Следовательно, механическая ткани диссоциации требует объединения тканей ^36, которые могут увеличить изменчивость и неоднородность образцов. Тем не менее, механической диссоциации может быть выбор, когда представляющий интерес антиген может быть изменена путем ферментативной диссоциации или, когда функциональные клеткис процентной необходимости быть сохранены (например., цитотоксичность NK клеток) ^35.

Использование протеолиза с конкретными ферментами, чтобы ухудшить ECM исключает низкие выходы, наблюдаемые с механической диссоциацией. Некоторые исследования показали использование трипсина ^{32, 37,} коллагеназы ДНКазы ³¹ диспазу ³⁸ и коммерческих коктейлей различных ферментов ^32,39. Однако природа и концентрация различных ферментов и продолжительность пищеварения должны быть тщательно определена и подтверждена, чтобы гарантировать поддержание целостности клеточных поверхностных антигенных эпитопов, необходимых для иммунофенотипирования. Различные структуры поверхности дифференциально восприимчивы к разрушению различными ферментами, с некоторыми ферментами, такими как трипсин, будучи известно, для зачистки поверхности лейкоцитов эпитопы, распознаваемые многих моноклональных антител.

Введенный здесь, представляет собой способ, использующий proteolytIC и коллагенолитической ферментативная коктейль, названный Accutase. Это решение ферментативного нежно достаточно в то же время эффективно диссоциации мышиных тканей на границе материнской плода, и не требует добавления других реагентов или диссоциирующих сыворотки, чтобы закончить реакцию диссоциации. Кроме того, он готов для использования в качестве подается и, хотя время диссоциации должно быть подтверждено, что более надежными, чем вышеуказанных ферментов ^40,41.

Использование комбинации обоих типов тканей дезагрегации улучшает качество и количество клеток, полученных; Таким образом, несколько исследований реализованы комбинированное применение механической и ферментативной диссоциации с удовлетворительными результатами ^31,32,37. Протокол, описанный здесь, был создан и утверждена в нашей лаборатории; он использует комбинацию мягкого механического диссоциации с последующим надежной ферментативной дезагрегации. Этот протокол позволяет изоляции и дальнейшее изучениев проникают лейкоциты в мышиных тканях на границе материнской плода (матка, децидуальной и плацента). Следующий протокол также поддерживает целостность маркеров клеточной поверхности и доходности достаточно жизнеспособных клеток для последующих применений, как показано с помощью анализа проточной цитометрии. Наконец, этот протокол поддерживает согласованность клеточного препарата для анализа и сравнения различных мышиных тканях, составляющих интерфейс материнской плода.