方法来提高高分辨率的敏感性疟疾熔单核苷酸多态性基因分型

注意：此协议包括体积和浓度为96孔板，8联管和毛细管为基础的系统（10微升反应体积）;然而，HRM，也可以在384孔平板的系统通过缩放所有卷相应进行了500微升反应体积。检测对于大多数系统的范围是10至第10纳克模板DNA。 1.准备模板直接从参与野外现场研究中的患者获得与全血储存血液，沉淀的红细胞，或在滤纸上获得的恶性疟原虫的样品。 注：样品也可以培养适应体外生长;一些标准实验室菌株进行分析可以从疟疾研究和参考试剂资源中心（MR4排序，样品可以直接从沉淀红血细胞或培养使用或从全血，红细胞，或滤纸萃取。 从提取的DNA滤纸或培养适应株注：人力资源管理是盐浓度敏感;由于可变提取方法浓度差异可能显著影响熔化温度。虽然具体最终缓冲区并不成功的显著的因素，使用标准的共同洗脱或悬浮缓冲液（ 即水 ，1个特['小特“或”DNA悬挂缓冲“：10毫摩尔Tris-CL，0.10毫摩尔EDTA]或1×TE [10mM的三Cl，1mM EDTA中]）对于所有样品，以避免异常的或不一致的熔融曲线。 准备模板稀释10微克-10纳克每微升的标准特，TE，或水，每10微升反应。 从沉淀的红血细胞的直接放大确定红细胞原虫使用超薄涂片显微镜注：可从美国疾病控制和预防中心（CDC）的方法来确定受感染的红血细胞的原虫：HTTP： //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html 在PCR级水，TE，或碲400的稀释：parasitemias 0.5％以上1。使用3微升为每5〜10微升反应。 控制注意：HRM可用于基因扫描，以检测在一个人口12序列变体;但是，准确的基因分型要求的标准序列验证，以包含SNP被审问。质粒构建或疟疾菌株与已知的基因型都可以使用。对于大多数应用，3D7（MR4 MRA-151）用作野生型对照。由于运行之间的变化，总是包括阳性和阴性对照。 阳性对照：准备10微克 – 10纳克每质粒1μl的稀释或标准将序列经过证明的SNP基因型。 阴性对照：用PCR级水作为一种无模板对照（NTC）的扩增反应。 ve_title“> 2。PCR扩增准备反应混合物 （可选）矿物油覆盖。注意：一些人力资源管理系统是独立熔化平台，并没有热盖，以防止扩增过程中凝聚和产品的蒸发。 加入20微升的轻质矿物油，每孔装版的反应混合物之前。 准备好所有的化验工作10倍的股票请参阅表1为推荐的10倍的股票工作浓度以及终浓度为阻止探针为基础的人力资源管理的基因分型。 准备反应混合物向每个孔中板或管中，加入1微升10X正向工作原液和反向引物和探针，4.0 – 5.0微升2.5倍或2.0倍的人力资源管理主混合物，1μl的模板，PCR级水为10微升的总反应体积。 盖板或试管使用光学薄板Seals的板为基础的放大，光纤帽带管为基础的系统，及塑料瓶盖毛细管为基础的系统。要确保覆盖已经完成，板和盖完全密封，并固定，防止扩增过程中蒸发。 旋转样品旋板3分钟，在1800×g离心以除去气泡，如果矿物油用于分离油相和水相。 扩增将反应板或管的热循环仪。运行标准的阻塞的探针或MAAB扩增方案（ 表2和3，分别）。注意在这些方法之间的退火温度的差异。 3.人力资源管理分析熔化 PCR扩增后，前往熔炼分析。对于不具有内置放大的独立熔炼系统 （如，BioFire防御LightScanner系统），再从热循环仪，并装在人力资源管理工具移动放大板。从系统软件接口，熔化板40 – 80℃下同时生产探针和扩增子的熔融峰。 注意：为了节省熔化和分析时间，熔化窗口可被缩短以覆盖温度范围只是探针或扩增子熔化区域。熔化后，将板和管可以再熔融如有必要并保存在-20℃或4℃。商店玻璃管仅在4℃，以防止管从开裂。 熔融分析删除负面样本在分析软件，从进一步的分析样本未扩增或有锯齿熔融峰删除。注意：选择分析模式针对单独运行文件后，仪器自动组的正和负样本。前基因型每个子集，用户可以手动改变呼叫。 无论是从融曲线或熔融峰认为，在曲线上右键单击要删除，选择它们。选择错误分类样本后，进入“新呼叫”，选择相应的组，然后单击“应用更改”。 规范化从标准化荧光的负导数相对于温度（-dF​​ / dT）的（'差分曲线“）视图，移动正常化棒以包围探针熔化区域。 注意：探针熔融区域是两个熔融区域的较低的温度。正常化杆应该在的熔融峰的碱。 计算组标准化后，选择“计算组的自动分配样本组。 如果需要的话，手动重新分配样品到特定组。 注：有些分析软件已经不能改变高灵敏度阈值;在这些情况下，作者oftware可以分配样本，以在视觉上属于另一个不同的组。 指定基因型基于标准（阳性对照），每个组分配的基因型。 在用户确认所计算的群体是正确的（如果不是，那正确的修改过的分组选项卡下选择错误分类样本，并从“新呼叫”旁边的下拉框中选择正确的组），选择“编辑组名“下的”分组“选项卡。 输入的标准基因型为相应的彩色框（例如，如果标准3D7有一个已知的A基因型，是红豆集团，红豆集团拥有基因型A）。按“确定”按钮，保存结果。 导出结果出口型称作为一个电子表格做进一步样本人群的分析。