Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per l'acquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements

La capacità di produrre segnali elettrici a lunga distanza è una caratteristica vantaggiosa di organismi pluricellulari che permette risposte efficaci agli stimoli esterni. Questa caratteristica si è evoluto in maniera indipendente in piante e animali, e rappresenta quindi un caso di evoluzione convergente. Dato che i segnali elettrici sono accoppiati con funzioni importanti in animali come trasmissione neurale e la contrazione muscolare, la base molecolare, il meccanismo di trasmissione, e la funzione di segnali elettrici di stimolo indotto negli animali sono oggetto di ricerca intensiva. Al contrario, lo stimolo indotto la segnalazione elettrica nelle centrali ha ricevuto scarsa attenzione della ricerca. Anche se le piante non hanno i nervi o muscoli, ci sembra essere prove sufficienti per supporre che i segnali elettrici di stimolo indotto nelle piante svolgono un ruolo chiave nelle loro risposte ai fattori ambientali.

Il floema, la componente vivente del sistema vascolare delle piante, è stata postulata come uno dei principali substrate per la trasmissione di segnali elettrici di stimolo indotto, da stimolato / danneggiato ad aree non stimolato / integri ^2. Le principali cellule del floema sono gli elementi setaccio (Ses),, cellule allungate relativamente semplici. Le estremità delle SE sono collegati ad altre SE, formando una continua, a bassa resistenza, sistema del tubo setaccio che si sviluppa per tutta la pianta. Vi sono, tuttavia, molto pochi studi sulle proprietà elettriche di queste cellule altamente specializzate. In questi studi precedenti, i ricercatori accessibili SE o con vetro micro-elettrodi ³ mandrini o con elettrodi di vetro che sono stati accoppiati a piantare-inseriti di afidi, dopo stylectomy (taglio) ^4. Microelettrodi di vetro sono realizzati da capillari di vetro che sono tirati ad una estremità con il calore in una punta sottile inferiore a 1 micron di diametro, e successivamente riempito con una soluzione di KCl. A Ag / AgCl o platino filo, inserito nel elettrodo di vetro KCl-riempita viene quindi collegato all'ingresso dell'amplificatore, e un referenteelettrodo viene inserito nella vasca che circonda la cella di interesse, completando il circuito. Questa configurazione registra la differenza di potenziale tra l'elettrodo extracellulare referente e l'elettrodo di misura intracellulare, cioè, il potenziale di membrana della cellula ^5. Con questo metodo, Umrath fatto la prima registrazione intracellulare da una cellula vegetale, utilizzando le alghe Nitella ^6,7. Nitella è relativamente semplice organismo a grandi cellule, e quindi suscettibili di esperimenti elettrofisiologia intracellulari. Al contrario, l'inserimento degli elettrodi di vetro intracellulari nelle piccole cellule, piante terrestri tridimensionali multicellulari è tecnicamente impegnativo, richiede un ricercatore altamente qualificato, nonché visualizzazione sofisticato, micromanipolazione e apparecchiature antivibrazione. Sebbene elettrodi di vetro sono adatti a registrare da cellule superficiali nelle piante, come le cellule epidermiche radice ^8, recordin intracellularegs dalle cellule profondamente radicate nel tessuto della pianta, come la SE, causa danno risposte indotte molto probabilmente, confondendo i risultati. Nel 1989, Fromm e Eschrich segnalato l'uso di un metodo alternativo, chiamato il 'metodo di afide', in cui gli elettrodi di vetro sono accoppiati a stiletti afidi dopo stylectomy ^4. Il metodo afide è minimamente invasiva, perché mandrini flessibili non causano tessuti o cellule danni elettrodi in vetro fanno. Mandrini afidi sono grande invenzione della natura per la penetrazione pianta, e gli afidi sono molto più abili di esseri umani nella ricerca di SE. Sfortunatamente, questo metodo afide è anche molto esigente in termini di competenze tecniche e attrezzature. Inoltre, il successo di ogni esperimento che implementa questa tecnica dipende interamente l'afide essere in modalità di alimentazione – con il mandrino stabilmente inserita in una SE, al momento della stylectomy. Pensare in retrospettiva, si può vedere che le probabilità di successo di questa tecnica avrebbe potuto essere improved aggiungendo al setup sperimentale uno strumento che consente di identificare se il mandrino è afidi in SE nell'applicazione stylectomy.

Nel 1964, McLean e Kinsey descritto un 'sistema di monitoraggio elettronico' per lo studio del comportamento alimentare di afidi in tempo reale ^9,10. In questo sistema, l'afide e l'impianto mandrino-penetrato sono stati integrati in un circuito elettrico. Successivamente, nel 1978, Tjallingii ideato una versione modificata del sistema, denominato sistema 'Electrical Penetrazione Graph' (EPG) ^11,12. Considerando che il sistema di controllo elettronico originale era sensibile alle potenzialità resistenza origine solo, con il sistema EPG, la forza elettromotrice (fem) originato potenziali, cioè, in un impianto o l'insetto, potrebbero essere registrati in aggiunta alle potenzialità derivanti dal resistenza (R) nella insetto. Questo rappresenta un miglioramento importante, perché sia ​​il segnale componenti, EMF e R,fornire biologico informazioni rilevanti sugli eventi durante la penetrazione pianta dagli afidi. Ciò che rende la EPG preamplificatore sensibile alle componenti R è relativamente bassa resistenza di ingresso 1 GΩ, che è vicino alla media della resistenza delle piante / afidi. Una piccola tensione di offset (Figura 1, V) di circa +100 mV viene applicato alla pianta, che viene poi suddivisa su piante e insetti da un lato, e la resistenza di ingresso sull'altro. Le tensioni e le loro variazioni sono misurate in un punto (Figura 1A, B) tra l'insetto e la resistenza di ingresso. Pertanto, le componenti R rappresentano modulazioni resistenza vegetale afide della tensione di offset, mentre i EMF-componenti sono una certa frazione di potenziali di piante al punta del mandrino e potenzialità causati nella insetto. I potenziali vegetali – più importanti qui – sono potenziali principalmente membrane delle cellule vegetali forati dai stiletti afidi. I potenziali insetti sembrano essere principalmentepotenziale di streaming causate da movimenti fluidi nei due canali stiletto, cioè, il cibo ei canali salivari; nessun potenziale nervose o muscolari interne sono registrate nel EPG. In pratica, le funzioni punta del mandrino come una punta dell'elettrodo. Tutte le cellule vegetali sono caricati negativamente all'interno rispetto all'esterno positiva della cellula. La corrente elettrica (cioè, il movimento di ioni in soluzione acquosa) scorre dall'interno verso l'esterno e vice versa è molto limitato a causa della elevata resistenza della membrana cellulare. Normalmente il potenziale di riposo viene mantenuta costante. Tuttavia, quando gli ioni negativi muovono fuori o ioni positivi si muovono attraverso la membrana cellulare, il potenziale di membrana è ridotto, cioè, 'depolarizza'. Depolarizzazione si verifica in caso di eccitazione delle cellule. Ioni quindi spostare avanti o indietro quando specifici canali ionici nella membrana vengono aperti o quando la membrana è danneggiata e ioni perdite dentro e fuori. Tutte le cellule hanno canali ionici e pompe in tegli membrana plasmatica che portano il potenziale di membrana al suo livello di riposo ripristinando la concentrazione originale di vari ioni all'interno della cellula. Il potenziale di riposo e le sue variazioni sono componenti EMF, e di conseguenza, la tecnica EPG è adatto a misurare loro.

Figura 1. EPG-elettrodi. L'EPG-elettrodo è un afide vivente integrato nel circuito elettrico Penetrazione Graph (EPG), il cui mandrino viene inserito in un elemento di setaccio (SE) in modalità di alimentazione stabile. Se il mandrino SE-infilzata è a riposo (pannello A), la tensione nel circuito, registrato da EPG, è stabile e al potenziale livello di riposo (pannello C, Rest). Se la SE è entusiasta, i suoi depolarizza membrana (pannello B), che viene visualizzato nella EPG come un graduale aumento della tensione (pannello C, Depolarizzazione). Come l'equilibrio ionico nella SE torna a riposare, cioè, repolarizes, la tensione registrata da EPG diminuisce gradualmente al potenziale livello di riposo (Panel C, ripolarizzazione). Nel pannello C, "A" e "B" si riferiscono agli scenari illustrati in pannelli A e B, rispettivamente. V = regolabile sorgente di tensione di offset. Ri = resistenza di ingresso. In parallelo alla resistenza esterna 1 GΩ, l'amplificatore ha un interno (nel OpAmp) alto 1,5 resistore TΩ (pannelli A e B, in grigio). Con il controllo remoto dello switch EPG pre-amp può essere cambiata da normale a EMF-mode, che permette di ottenere valori di tensione ad alta precisione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Nella sezione successiva, mettiamo a disposizione il lettore con un protocollo di base per l'esecuzione di esperimenti EPG che sia valido per entrambi gli studi insetti focalizzati e vegetali a fuoco.