Une nouvelle application de l'électrique pénétration Graphique (EPG) pour l'acquisition et la mesure des signaux électriques dans le phloème Sieve Elements

La capacité de produire des signaux électriques à longue distance est un trait avantageux d'organismes multi-cellulaires qui permet des réponses efficaces à des stimuli externes. Ce trait a évolué de façon indépendante dans les plantes et les animaux, et représente donc un cas d'évolution convergente. Étant donné que les signaux électriques sont couplés avec des fonctions importantes chez les animaux tels que la transmission neuronale et la contraction musculaire, la base moléculaire, le mécanisme de transmission, et en fonction de signaux électriques induits stimulus chez l'animal sont des sujets de recherche intensive. En revanche, induite stimulus-signalisation électrique dans les usines a reçu peu d'attention de la recherche. Bien que les plantes ont pas de nerfs ou des muscles, il semble y avoir suffisamment de preuves pour supposer que les signaux électriques induits relance dans les plantes jouent un rôle clé dans leurs réponses à des facteurs environnementaux.

Le phloème, la composante vivante de la vascularisation de la plante, a été postulé comme un sous majeureStrate pour la transmission de signaux électriques induits par stimulus, de stimulé / endommagé dans des zones non stimulées / ² non endommagés. Les principales cellules du phloème sont les éléments de tamis (SES), des cellules simples et relativement allongées. Les extrémités de SES sont connectés à d'autres PME, la formation d'une, de faible résistance continue, le système de tube tamis qui se propage dans toute la plante. Il ya, cependant, très peu d'études sur les propriétés électriques de ces cellules hautement spécialisées. Dans ces études précédentes, les chercheurs accessibles SE soit avec verre micro-électrodes ³ stylets ou avec des électrodes de verre qui ont été couplées à planter-insérés de pucerons, après stylectomy (coupe) ^4. Microélectrodes de verre sont fabriqués à partir de capillaires en verre qui sont tirés à une extrémité avec la chaleur en une fine pointe de moins de 1 m de diamètre, puis remplis avec une solution de KCl. Un Ag / AgCl ou de platine métallique, inséré dans l'électrode de verre rempli de KCl est ensuite reliée à l'entrée de l'amplificateur, et un référentélectrode est inséré dans le bain environnant la cellule d'intérêt, l'achèvement du circuit. Cette configuration enregistre la différence de potentiel entre l'électrode extracellulaire référent et l'électrode de mesure intracellulaire, à savoir, le potentiel de membrane de la cellule ^5. Avec cette méthode, Umrath fait le premier enregistrement intracellulaire d'une cellule de plante, en utilisant la ^6,7 Nitella algues. Nitella est un organisme relativement simple à grandes cellules, et donc prête à des expériences électrophysiologiques intracellulaires. En revanche, l'insertion d'électrodes de verre intracellulaires dans les petites cellules de plantes terrestres multi-cellulaires, en trois dimensions est techniquement exigeante, nécessite un chercheur hautement qualifiée, ainsi que la visualisation sophistiquées, micromanipulation, et de l'équipement anti-vibration. Bien que les électrodes de verre sont aptes à enregistrer à partir de cellules superficielles dans les plantes, telles que des cellules de l'épiderme de la racine ^8, recordin intracellulairegs de cellules profondément ancrées dans les tissus de la plante, tels que SES, très susceptible de causer des dommages-réponses induites, confondant les résultats. En 1989, Fromm et Eschrich rapporté l'utilisation d'une autre méthode, appelée «méthode de pucerons», dans lequel des électrodes de verre sont couplés à des stylets de pucerons après stylectomy ^4. La méthode de puceron est peu invasive, parce stylets souples ne causent pas de tissus ou de cellules de dégâts que des électrodes de verre font. stylets de pucerons sont grande invention de la nature pour la pénétration de l'usine, et les pucerons sont beaucoup plus qualifiés que les humains à trouver SE. Malheureusement, cette méthode de pucerons est également très exigeant en termes d'expertise et de l'équipement technique. De plus, le succès de chaque expérience, qui met en oeuvre cette technique dépend entièrement du puceron étant en mode d'alimentation – de manière stable avec le stylet inséré dans une SE, au moment de stylectomy. Penser en rétrospective, on peut voir que les chances de succès de cette technique auraient pu improved en ajoutant au dispositif expérimental d'un instrument qui permet d'identifier si oui ou non le mandrin de pucerons se trouve dans la SE lors de l'application stylectomy.

En 1964, McLean et Kinsey ont décrit un «système de surveillance électronique» pour l'étude du comportement d'alimentation des pucerons en temps réel ^9,10. Dans ce système, le puceron et l'usine de stylet-pénétré ont été intégrés dans un circuit électrique. Plus tard, en 1978, Tjallingii conçu une version modifiée du système, appelé le système «traversées électriques Graph» (EPG) ^11,12. Alors que le système électronique de surveillance initiale était sensible aux potentiels de résistance-son origine seulement, avec le système EPG, la force électromotrice (fem) originaire potentiels, à savoir, généré dans l'usine ou dans l'insecte, pourraient être enregistrées en plus à des potentiels découlant de résistance (R) dans l'insecte. Cela représente une amélioration importante, parce que les deux composantes du signal, EMF et R,fournir des informations pertinentes sur les événements biologiques lors de la pénétration de l'usine par les pucerons. Ce qui rend le pré-amplificateur EPG sensible aux R-composants est relativement faible résistance d'entrée de 1 GQ, qui est proche de la moyenne de la résistance plante / puceron. Une petite tension de décalage (figure 1, V) d'environ 100 mV est appliqué sur la plante, qui est ensuite divisé pour plantes et les insectes d'un côté, et la résistance d'entrée de l'autre. Les tensions et leurs changements sont évalués à un point (figure 1A, B) entre l'insecte et la résistance d'entrée. Par conséquent, les R-composants représentent résistance modulations de plantes-pucerons de la tension de décalage, alors que les EMF-composants sont d'une certaine fraction du potentiel de la plante à la pointe du stylet et des potentiels causés dans l'insecte. Les potentiels de plantes les plus pertinents – – ici sont principalement des potentiels membranaires des cellules végétales poinçonnés par les stylets de pucerons. Les potentiels d'insectes semblent être principalementpotentiels d'écoulement causées par des mouvements fluides dans les deux canaux stylet, à savoir, la nourriture et les canaux salivaires; aucun nerveuses ou musculaires potentiels internes sont enregistrées dans l'EPG. Dans la pratique, les fonctions de pointe de stylet comme une pointe d'électrode. Toutes les cellules végétales sont chargées négativement à l'intérieur par rapport à l'extérieur de la cellule positif. Le courant électrique (par exemple, le mouvement des ions chargés en solution aqueuse) découlant de l'intérieur vers l'extérieur et vice versa est très limitée en raison de la forte résistance de la membrane cellulaire. Normalement, le potentiel de repos est maintenue constante. Toutefois, lorsque des ions négatifs ou des ions quittent positifs se déplacent en travers de la membrane cellulaire, le potentiel de la membrane est réduite, à savoir, ce dépolarise. Dépolarisation se produit en cas d'excitation de la cellule. Ions se déplacent ensuite ou lorsque des canaux ioniques spécifiques dans la membrane sont ouvertes ou lorsque la membrane est endommagée et des ions de fuite dans et hors. Toutes les cellules ont des canaux ioniques et des pompes à til plasma membrane qui apportent le potentiel de membrane à son niveau de repos en rétablissant la concentration initiale de divers ions dans la cellule. Le potentiel de repos et ses changements sont des éléments EMF, et par conséquent, la technique EPG est adapté pour les mesurer.

Figure 1. EPG-électrodes. L'EPG-électrode est un puceron vivant intégré dans le circuit électrique de pénétration Graphique (EPG), dont le stylet est inséré dans un élément de tamis (SE) en mode d'alimentation stable. Si le stylet-empalé SE est au repos (panneau A), la tension dans le circuit, enregistrée par EPG, est stable et au niveau potentiel de repos (Groupe C, repos). Si le SE est excité, ses dépolarise la membrane (panneau B), qui est visualisé dans l'EPG comme une augmentation progressive de la tension (panneau C, dépolarisation). Comme l'équilibre ionique dans la SE revient au repos, à savoir, il repolarizes, la tension enregistrée par EPG diminue progressivement au niveau potentiel de repos (Groupe C, repolarisation). Dans le panneau C, «A» et «B» font référence aux scénarios présentés dans les panneaux A et B, respectivement. V = source de tension de décalage réglable. Ri = résistance d'entrée. En parallèle à la résistance externe 1 GQ, l'amplificateur a une interne (dans le OpAmp) haute résistance de 1,5 TΩ (panneaux A et B, en gris). Par la télécommande de l'interrupteur de la pré-ampli EPG peut être modifié à la normale aux CEM-mode, qui permet d'obtenir des valeurs de tension très précis. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Dans la section suivante, nous fournissons le lecteur avec un protocole de base pour réaliser des expériences EPG qui est valable pour les deux études insectes concentré et végétales ciblée.