تطبيق جديد من الاختراق الرسم البياني الكهربائية (EPG) للحصول على وقياس الإشارات الكهربائية في اللحاء المنخل عناصر
Summary
Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.
Abstract
وغالبا ما تتم دراسة الخصائص الكهربية للخلايا في المختبر، بعد عدم الربط بينها وبين بيئاتها الأصلية. ومع ذلك، تتطلب دراسة نقل الطاقة الكهربائية بين الخلايا البعيدة في كائن حي في الجسم الحي، والتسجيلات خالية من القطع الأثرية من الخلايا جزءا لا يتجزأ من داخل بيئتهم المحلية. نقل الإشارات الكهربائية من الجرحى إلى المناطق المعافين في مصنع منذ زمن بعيد منزعج من مصلحة علماء النبات. اللحاء، وجزءا حيا من الأوعية الدموية النبات الذي ينتشر في جميع أنحاء المصنع، تم افتراضه بمثابة الأنسجة الرئيسية في نقل الطاقة الكهربائية في محطات. عدم وجود طرق الكهربية مناسبة يطرح العديد من التحديات لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا اللحاء في الجسم الحي. هنا نقدم نهجا جديدا للالكهربية داخل الخلايا من العناصر غربال (SES) الذي يستخدم المن الحية أو غيرها من الحشرات hemipteran الرضاعة اللحاء ومتكامل في اختراق جرا الكهربائيةالرقم الهيدروجيني (EPG) الدائرة. جعلت براعة، متانة، ودقة هذه الطريقة من الممكن أن يسجل ويدرس في التفاصيل الإشارات الكهربائية الناجم عن جرح في المؤسسات الصغيرة الأوردة المركزية للمصنع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana 1. نحن هنا تبين أن EPG-الأقطاب يمكن تنفيذها بسهولة لالتسجيلات الكهربية داخل الخلايا من المؤسسات الصغيرة في الأوردة هامشية، وكذلك لدراسة قدرة المؤسسات الصغيرة على الاستجابة مع إشارات كهربائية لعدة مؤثرات الخارجية. النهج EPG تطبيقها على الخلايا الكهربية من المؤسسات الصغيرة يمكن تنفيذها لمجموعة واسعة من أنواع النباتات، في عدد كبير من مجموعات محطة / الحشرات، ويهدف العديد من البحوث.
Introduction
القدرة على إنتاج الإشارات الكهربائية لمسافات طويلة هي سمة مفيدة من الكائنات متعددة الخلايا التي تسمح للاستجابات فعالة للمؤثرات الخارجية. وقد تطورت هذه الصفة بشكل مستقل في النباتات والحيوانات، وبالتالي يمثل حالة تطور متقاربة. وبالنظر إلى أن الإشارات الكهربائية تقترن مع وظائف هامة في الحيوانات مثل انتقال العصبية وانقباض العضلات، والأساس الجزيئي، وآلية انتقال، وظيفة من الإشارات التي يسببها التحفيز الكهربائية في الحيوانات هي المواضيع من البحث المكثف. في المقابل، تلقت إشارات الكهربائية الناجم عن التحفيز في النباتات الاهتمام القليل من البحث. على الرغم من أن النباتات لديها أي الأعصاب أو العضلات، ويبدو أن هناك أدلة كافية لافتراض أن الإشارات الكهربائية الناجم عن التحفيز في النباتات تلعب دورا رئيسيا في ردودها على العوامل البيئية.
وقد افترض اللحاء، المكون يعيشون في الأوعية الدموية النبات، كبند فرعي رئيسيإستراتيجيات لنقل الإشارات الكهربائية الناجم عن التحفيز، من حفز / تلف إلى مناطق غير حفز / التالفة 2. الخلايا الرئيسية في اللحاء هي العناصر غربال (SES)، وخلايا بسيطة نسبيا، ممدود. ترتبط نهايات المؤسسات الصغيرة مع غيرها من المؤسسات الصغيرة، وتشكيل المستمرة، وانخفاض المقاومة، نظام أنبوب غربال التي تنتشر في جميع أنحاء المصنع. هناك، ومع ذلك، عدد قليل جدا من الدراسات على الخواص الكهربائية من هذه الخلايا المتخصصة للغاية. في هذه الدراسات السابقة، الوصول الباحثين المؤسسات الصغيرة إما الزجاج الصغيرة أقطاب-3 قلم دقيق أو مع أقطاب الزجاج التي كانت إلى جانب لزرع إدراجها من المن، بعد stylectomy (القطع) 4. مصنوعة الميكروية الزجاج من الزجاج الشعيرات الدموية التي يتم سحبها في نهاية واحدة مع الحرارة في تلميح على ما يرام أقل من 1 ميكرون في القطر، وشغل بعد ذلك بمحلول بوكل. ثم تم توصيل حج / أجكل أو البلاتين الأسلاك، وإدراجها في الزجاج الكهربائي بوكل شغل لمدخلات مكبر للصوت، والمرجعيتم إدراج الكهربائي في حمام المحيطة خلية من الاهتمام، واستكمال الدائرة. هذا الإعداد يسجل الفرق في الإمكانيات بين القطب خارج الخلية المرجع والقطب قياس الخلايا، أي إمكانية غشاء الخلية 5. مع هذا الأسلوب، أدلى Umrath أول تسجيل داخل الخلايا من الخلايا النباتية، وذلك باستخدام الطحالب Nitella 6،7. Nitella هو كائن بسيط نسبيا مع الخلايا الكبيرة، وبالتالي قابلة للتجارب الكهربية داخل الخلايا. في المقابل، فإن إدخال أقطاب الزجاج داخل الخلايا إلى خلايا صغيرة من النباتات البرية متعددة الخلايا، ثلاثية الأبعاد يتطلب تقنية عالية، يتطلب الباحث من ذوي المهارات العالية، فضلا عن التصور متطورة، المجهرية، ومعدات مضادة للاهتزاز. على الرغم من أقطاب الزجاج هي مناسبة لتسجيل من الخلايا السطحية في النباتات، مثل خلايا البشرة جذر 8، recordin داخل الخلاياع من الخلايا متأصلة في نسيج النبات، مثل المؤسسات الصغيرة، والسبب ردود الناجم عن الضرر المحتمل جدا، الخلط بين النتائج. في عام 1989، ذكرت فروم وEschrich استخدام طريقة بديلة، ودعا "طريقة أولا بأول"، والتي تقترن أقطاب الزجاج لقلم دقيق المن بعد stylectomy 4. طريقة المن هو الغازية الحد الأدنى، لأن قلم دقيق مرنة لا تسبب الأنسجة أو تلف الخلايا كما تفعل أقطاب الزجاج. قلم دقيق المن هي اختراع طبيعة العظيم لاختراق النبات، والمن هي إلى حد كبير أكثر مهارة من البشر في إيجاد المؤسسات الصغيرة. للأسف، هذا الأسلوب المن هو أيضا تطلبا للغاية من حيث الخبرة والمعدات التقنية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نجاح كل تجربة التي تطبق هذه التقنية تعتمد اعتمادا كليا على المن كونها في وضع التغذية – مع مرود إدراج مستقر إلى SE، في وقت stylectomy. التفكير في بأثر رجعي، يمكن للمرء أن يرى أن احتمالات نجاح هذه التقنية يمكن أن يكون طmproved عن طريق إضافة إلى الإعداد التجريبية أداة تسمح تحديد ما إذا كان أو لم يكن مرود المن هو في SE عند تطبيق stylectomy.
في عام 1964، وصفت ماكلين وكينزي على "نظام المراقبة الإلكترونية" لدراسة سلوك التغذية من المن في الوقت الحقيقي 9،10. في هذا النظام، تم دمج المن والنبات اخترقت مرود في الدائرة الكهربائية. في وقت لاحق، في عام 1978، وضعت Tjallingii نسخة معدلة من النظام، ودعا "الكهربائية الاختراق الرسم البياني" (EPG) نظام 11،12. في حين أن نظام المراقبة الإلكترونية الأصلي حساسية لإمكانات نشأت المقاومة فقط، مع نظام EPG، والقوة الدافعة الكهربائية (EMF) نشأت إمكانات، أي ولدت في المصنع أو في الحشرات، ويمكن أن تسجل بالإضافة إلى الإمكانيات الناشئة عن المقاومة (R) في الحشرات. وهذا يمثل تحسنا هاما، لأن كلا إشارة المكونات، EMF وR،توفير المعلومات البيولوجية ذات الصلة بشأن الأحداث أثناء الإيلاج المصنع من المن. ما يجعل EPG قبل مكبر للصوت حساسية لR-مكونات غير التي منخفضة نسبيا المقاومة مدخلات 1 GΩ، التي هي قريبة من متوسط مقاومة النبات / أولا بأول. A تعويض الجهد الصغيرة (الشكل 1، V) تقريبا +100 يطبق بالسيارات لهذا المصنع، الذي ثم يتم تقسيم عبر نبات وحشرات على جانب واحد، ومقاومة المدخلات من جهة أخرى. يتم قياس الفولتية والتغييرات الخاصة بهم عند نقطة (الشكل 1A، B) بين الحشرة والمقاوم الإدخال. ولذلك، فإن R-مكونات تمثل التحويرات مقاومة النبات أولا بأول من تعويض الجهد، في حين أن للمكونات المجالات الكهرومغناطيسية هي جزء معين من إمكانات المصنع في الطرف مرود والإمكانات تسبب في الحشرات. إمكانات المصنع – الأكثر صلة هنا – هي إمكانات غشاء أساسا من الخلايا النباتية من خلال ثقب قلم دقيق أولا بأول. تظهر إمكانات الحشرات لتكون أساساإمكانات تدفق الناشئة عن حركات السوائل داخل اثنين من القنوات مرود، أي الطعام والقنوات اللعابية. لم يسجل اي الأعصاب أو العضلات الإمكانيات الداخلية في EPG. في الممارسة العملية، وظائف مرود طرف باعتبارها طرف القطب. واتهم كل الخلايا النباتية سلبا داخل نسبة إلى خارج إيجابي للخلية. التيار الكهربائي (أي حركة الأيونات في المحلول المائي) التي تتدفق من الداخل إلى الخارج والعكس بالعكس محدودة جدا بسبب مقاومة عالية من غشاء الخلية. عادة يتم الاحتفاظ إمكانات يستريح المستمر. ومع ذلك، عندما تتحرك الأيونات السالبة خارج أو الأيونات الموجبة تتحرك في خلال غشاء الخلية، يتم تقليل غشاء المحتملة، أي انها depolarizes. يحدث الاستقطاب في حالة من الإثارة الخلية. أيونات ثم الانتقال داخل أو خارج عندما يتم فتح القنوات الأيونية محددة في الغشاء أو عند تلف الغشاء والأيونات تسرب داخل وخارج. جميع الخلايا لها قنوات ومضخات ايون في تيانه البلازما الغشاء الذي جعل غشاء المحتملة إلى مستوى الراحة من خلال إعادة تركيز الأصلي من مختلف الأيونات داخل الخلية. إمكانيات الراحة وتغيراته هي مكونات EMF، وبالتالي، فإن تقنية EPG مناسبة لقياس لهم.
الشكل 1. EPG-الأقطاب. وEPG القطب هو المن المعيشة دمجها في الاجهزة الكهربائية الاختراق الرسم البياني (EPG) الدائرة، التي يتم إدراجها في عنصر غربال (SE) في وضع مستقر التغذية مرود. إذا كان SE-مخوزق مرود هو في بقية (لوحة A)، والجهد في الدائرة، التي سجلتها EPG، مستقر وعلى مستوى المحتملين يستريح (لوحة C، الراحة). إذا كان SE هو متحمس، depolarizes لها غشاء (لوحة B)، التي تصور في EPG كما زيادة تدريجية في الجهد (لوحة C، الاستقطاب). كما التوازن الأيوني في SE يعود للراحة، أي أنها repolarizes، والجهد التي سجلها EPG يتناقص تدريجيا إلى مستوى محتمل بقية (لوحة C، عودة الاستقطاب). في لوحة C، "A" و "B" الرجوع إلى سيناريوهات معروضة في لوحات A و B، على التوالي. V = قابل للتعديل مصدر الجهد الإزاحة. ري = المقاوم الإدخال. بالتوازي مع المقاوم الخارجية 1 GΩ، مكبر للصوت لديه الداخلية (في OPAMP) ارتفاع 1.5 TΩ المقاوم (لوحات A و B، باللون الرمادي). عن طريق التحكم عن بعد للتبديل EPG قبل أمبير يمكن تغيير من الطبيعي أن المجالات الكهرومغناطيسية واسطة، والذي يسمح بالحصول على قيم الجهد دقيقة للغاية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
في المقطع التالي، ونحن نقدم للقارئ بروتوكول الأساسي لإجراء التجارب EPG صالحة لكلتا الدراستين الحشرات التي تركز والتي تركز على النبات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتنص هذه المادة على بروتوكول مفصلة لصنع الكهربائية الاختراق الرسم البياني (EPG) التسجيلات. يتم تأسيس تقنية EPG بشكل جيد، مع 100-200 مستخدم نشط في جميع أنحاء العالم، وقد تم تنفيذه للعديد من الدراسات حول مواضيع مختلفة، على سبيل المثال: أ) مقاومة النبات المضيف إلى المن وغيرها ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد VSR من قبل معهد التمويل الدولي ماري كوري جرانت (جرح في EARTH، اختصار ل: الجرح الناجم عن الإشارات الكهربائية في نبات الأرابيدوبسيس thaliana).
Materials
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is x10 | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A., Brette, R., Destexhe, A. Intracellular Recordings. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
