Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em> In Situ</em> Hybridation

Le recrutement d'ARNm axonale et la traduction locale permettent axones à répondre à des stimuli extracellulaires d'une manière temporellement et spatialement aiguë ^1. La synthèse des protéines intra-axonal est mieux compris dans le contexte de développement neurologique où elle joue un rôle crucial dans la croissance cône comportement ^{8.2, 11.9} et des axones signalisation rétrograde ^12,13. Mais loin en sait moins sur la signification fonctionnelle de la synthèse des protéines axonale dans les neurones post-développement lorsque les niveaux d'ARNm et de ribosome axonales sont considérablement réduits ^14,15. Axones vertébrés matures ont longtemps été pensé pour être inactive translation ^16. Cependant, des études récentes indiquent que la traduction locale est réactivé dans les axones matures dans des conditions pathologiques. Par exemple, un sous-ensemble des ARNm est recruté pour axones après une lésion du nerf et de la synthèse des protéines intra-axonal est nécessaire pour la régénération correcte de ces axones ^17. En outre, notre ha de groupes a montré que les ARNm spécifiques sont recrutés pour des axones après une exposition locale à la maladie d'Alzheimer peptide Aß _1-42, et de la traduction locale ATF4 facteur de transcription est nécessaire pour propager les effets neurodégénératifs de Aß _1-42 de axones au soma neuronal ^18. Enfin, les analyses à haut débit ont révélé que les axones matures ont un transcriptome plus complexe et dynamique que prévu ^18-21, en ​​particulier dans des conditions pathologiques. À la lumière de ces études, une méthode hautement sensible et spécifique pour détecter les ARNm axonaux localisées dans le système nerveux adulte est nécessaire.

Une grande partie du travail sur le recrutement de l'ARNm et la traduction locale dans les axones matures a été effectuée sur des neurones en culture. Cela est particulièrement vrai pour les analyses de transcriptome car les méthodes de culture spécialisés existent qui permettent l'isolement des axones de la somato-dendritique compartiment ^18-20. Bien que ces études ont donné ins précieusesight dans le rôle de la traduction locale dans les axones matures, la question de savoir si des neurones en culture représentent fidèlement la situation in vivo ou si le recrutement ARNm est une réponse adaptative des axones à conditions de culture est toujours ouverte. Peu d'études ont fourni des preuves de recrutement d'ARNm de mûrir axones in vivo. Par exemple, la transcription codant pour la protéine de marquage olfactif a été détectée dans les axones des neurones sensoriels adultes ^22. Un transgène contenant l'extrémité 3 'UTR de l'ARNm de β-actine est transporté vers les axones des neurones du système nerveux central et périphérique chez des souris et se traduit localement après ²³ périodes de développement. Lamin de l'ARNm est localisée aux axones de la rétine dans Xenopues laevis têtards et son épuisement affecte l'entretien de l'axone après le développement des axones ^21. Interférence avec le transport axonal de l'ARNm codant pour la cytochrome C oxydase IV modifie le comportement de la souris ^24. Enfin, ATF4 ARNm se trouve dans un adulteXons des souris et des cerveaux humains dans le contexte de Aß _1-42 induite par la neurodégénérescence ^18.

Analyses du transcriptome à haut débit se sont avérées utiles pour identifier les profils d'ARNm dans les axones isolés in vitro, mais avoir des limites pour des études in vivo depuis dans les tissus entiers axones ne se trouvent jamais dans l'isolement, mais entremêlées avec les organes de cellules neuronales, cellules gliales et d'autres types de cellules. Ainsi, de telles analyses doivent être combinées avec des techniques d'imagerie qui confirment la localisation subcellulaire des ARNm. Hybridation in situ de l'ARN (ARN ISH) en permet la détection et la visualisation des séquences d'ARN spécifiques dans les cellules et les tissus. Cependant, les tests ARN ISH originaux étaient conviennent que pour l'identification des ARN très abondantes ^25, ce qui est rarement le cas pour les ARNm axonaux localisées. Pour les dernières décennies des efforts accrus ont été mis en développant de nouvelles technologies qui permettent la détection des ARNm au niveau d'une seule molécule <sup> 25,26. Par exemple, Singer et ses collègues ont mis au point des sondes ISH pour détecter des ARNm dans des cellules individuelles, consistant à 5 non-chevauchement marqué par fluorescence 50-mères (pour plus de détails se réfèrent à ^27). La principale différence entre les techniques mentionnées ci-dessus et celle décrite ici est que le plus tard, utilise 20 à double Z-structure (pas linéaire) sondes qui ciblent typiquement ~ 1 kb région de l'ARN d'intérêt assurant la spécificité et faible niveau de fond. Les sondes sont ensuite hybridées avec préamplificateur et l'amplificateur des séquences qui sont finalement marqué par fluorescence ou conjugués avec des enzymes qui permettent des réactions chromogènes. Ces étapes d'amplification d'améliorer le rapport signal-bruit par rapport à d'autres technologies de ISH ^28. Nous décrivons ici deux protocoles utilisant RNAscope associée, soit à fluorescence immunocytochimie ou avec des colorants histologiques permettant contre-coloration axonale. Les deux protocoles sont appropriés pour visualiser la localisation axonale des ATF4 ARNm dans mo adultesutiliser et les cerveaux humains.