리소 레시틴의 초점 주사 실험 탈수 초화 및 설치류 척수의 재유 수화

참고 :이 절차에 사용 된 동물은 동물 관리에 캐나다위원회 (CCAC) 지침에 따라 마음에 든다고했다. 윤리는 캘거리 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 1. 주입 주사기를 준비 (하여 pH 7.4 PBS) 및 매장 작은 분취 량에서 -20 ° C (75 μL)에 인산 완충 식염수에 1 % 용액에 리소 레시틴 녹인다. RT에 유리 병을 녹여. 주 : 리소 레시틴이 불용 인 경우, 균일 한 용액을 형성하기 위해 약 30 분 동안 초음파 세척기 (40 kHz로)에서 튜브를 초음파 처리. 섬세한 팁을 손상을 방지하기 위해 매우 조심 미리 뽑아 유리 모세관을 처리합니다. 10 μL 주입 주사기의 너트를 풀어 페룰 정합 단부 정렬하고 모세관 원추형 페룰 (도 1)에 꼭임을 보장이 페룰이어서 모세관의 평평한 단부에 그것을 스레드. isoprop와 주사기를 씻어일 알코올과 플런저를 제거합니다. 건조되면, 주입 주사기에 꽉 니들 어셈블리 손을 조입니다. 프라이밍 주사기에 금속 허브 바늘을 연결합니다. 피어스 바늘 고무 디스크를베이스로 아래로 밀어 넣습니다. 리소 레시틴과 프라이밍 주사기를 입력합니다. 액체가 바늘의 끝에서 보일 때까지 조심스럽게 프라이밍 주사기를 우울. 이것은 기포가 주입 주사기로 도입되지 보장한다. 주입 주사기로 프라이밍 주사기의 금속 허브 바늘을 삽입합니다. 모세관이 솔루션을 끝으로 채울 때까지 고무 디스크와 함께 회사 인감 만들기, 천천히 프라이밍 주사기를 우울. 동시에 공기 방울을 도입하지 않고 주입 주사기의 배럴을 채우기 위해 누르면서 조심스럽게 프라이밍 주사기를 제거합니다. 주입 주사기로 플런저를 삽입하고 플런저가 부드럽게 눌려로 솔루션은 모세관의 끝에서 흘러 확인합니다. 주 : 기포가 모자에서 볼 수있는 경우illary 또는 주사기를 주입 주사기 제제는 처음부터 반복한다. 분사 장치에 연속 유체는 정확한 주입량을 보장하는 것이 중요하다. 정위 미세 조작기의 팔에 완성 된 주입 주사기를 연결합니다. 이 완료 장치는 리필 할 필요가 전에 15 ~ 20 동물을 주입 할 수있을 것입니다. 프라이밍 주사기에 남아있는 리소 레시틴을 폐기하십시오. 철회 및 이소 프로필 알코올을 여러 번 우울, 및 금속 바늘 허브를 분리. 다시 채우기 전에 증발 프라이밍 주사기에 남아있는 이소 프로필 알코올 몇 시간을 기다립니다. 2. 수술을 위해 동물을 준비 참고 :이 절차는 여성 C57BL / 6 마​​우스, 세 8~10주에 대해 설명한다. 케타민 (200 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 제도적 동물 보호 규정에 따라 복강 내 주사하여 동물을 마취. 계획주사 마취를 사용하는 경우 동물은 약 ​​1 시간 동안 마취를합니다. 동물 깊이 단단히 발을 집어 마취되어 있는지 테스트합니다. 제대로 마취 동물은 핀치에 응답하지 않습니다. 가위를 사용하여 귀 가까이에 동물의 등쪽면에 2 ~ 3 ㎠로 영역을 면도. 귀 손상되지 않도록주의하십시오. 거즈 패드에 적용되는 70 % 에탄올로 청소 영역을 닦습니다. 모든 잘린 머리를 제거한 다음 확인합니다. 요오드 영역 소독. 건조 과정에 걸쳐 방지하기 위해 눈에 바셀린을 적용한다. 절차를 시작할 준비가 될 때까지 가열 회수 챔버에 동물을 유지. 3. 수술 절차를 수행 참고 : 절차의 모든 단계에 대한 적절한 무균 기술을 확인합니다. 이 장갑, 머리망, 마스크 및 커튼의 적절한 사용을 포함한다. 모든 도구는 마 contac에 오기 전에 소독해야한다동물과 t. 정위 프레임에 동물을 이동, 등쪽면이 위로, 척추의 만곡을 과장 접힌 종이 타월로 중간 부분에서 상승. 수술 테이프로 팔과 꼬리를 고정하고 치아 클램프로 머리를 고정합니다. 안정화 귀 바는이 절차가 필요하지 않습니다. 바로 귀 아래에서 시작하여 꼬리 방향으로 절단, 3cm의 중간 선 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다. 2 개의 대형 지방 구조 사이의 격차를 찾아이 떨어져 가져 오기 위해 각 손에 미세 집게를 사용합니다. 수술 부위를 엽니 다 견인기를 확산. 수술 현미경, T2 척추의 저명한 가지 프로세스를 찾습니다 (참고 :이 기능은 C57BL / 6 마​​우스 변형의 특징이다). 더 나은 T2를 시각화하기 위해 오버레이 근육을 폐쇄 봄 가위와 무딘 절개를 수행합니다. 집게를 사용하여, 적절한 해부학 적 위치를 확인하기 위해 T3와 T4의 하드 표면에 대한 느낌. 봄 가위를 사용하여, T3와 T4 사이의 결합 조직 (2~3mm 깊이) 얕은 측면 인하합니다. 때문에 마우스 척추의 상부 흉추 부분의 척추 사이의 자연 공간에, 후궁 절제술은 척수를 공개 할 필요가 없습니다. 너무 깊은 상처가 관통하고 코드가 손상 될 수 있음을 염두해야합니다. 참고 : 출혈의 작은 정도가이 단계에서 일반적입니다. 이 경우, 출혈이 가라 (30 ~ 60 초)까지 영역에 스폰지 창을 누르고 있습니다. 척수를 시각화. 코드를 노출하면서이 수막 층이 아직 절단되지 않은 경우는 볼 수 경질의 두꺼운 층으로 덮여됩니다. 눈에 띄는 혈관은 척수의 대략적인 중간 선을 통해 꼬리 / 주동이를 실행합니다. 참고 :이 혈관은 중간 선을위한 랜드 마크로서 사용할 수 없습니다. 대신, 적절한 조명은 등쪽 열 측부 회백색 물질 경계 공개해야하며, 이는 정중선을 추정하는데 사용될 것이다. 경질 경우이 지워질 때까지 그대로 유지, 32 G 금속 바늘로 부드러운 측면 긁힌 자국을합니다. 목표는 두껍고보고 열심히하지 않은 나머지 기본 수막을 절단하지 않으면 서 경질을 제거하는 것입니다. 참고 : 뇌척수액의 출시는 거미의 위반을 표시하고이 조직에 기계적인 손상없이 발생할 수 있습니다 동안 축적 된 뇌척수액이 더 나은 코드의 표면을 시각화하기 위해 스폰지 창으로 제거해야합니다. 장소에 주입 주사기를 이동하고 모세관의 끝이 겨우 정중선의 양쪽의 바로 옆의 척수에 닿을 때까지 천천히 내립니다. 장소에 팔을 잠급니다. 기준 위치 측정을 할 수있는 Z 방향 정위 아암의 등급 측정을 사용한다. 이 독서에서 1.3 mm를 뺍니다. 조직을 관통하는 빠르고 얕은 하향 움직임을 사용하여 새로운 측정에 도달 할 때까지 조심스럽게 모세관을 낮 춥니 다. 옵션 : 원하는 경우,등의 열에서 병변은 정중선에서 동일한 피어싱 모션 및 0.3 mm (자세한 내용은 설명을 참조)의 깊이에 의해 제조 할 수있다. 참고 :이 값은 T3와 T4 사이에 주입하기위한 고유합니다. 척수의 다른 위치에 주사를 수행하는 말인가하면,이 값은 사용 가능한 마우스 뇌지도 책에서 파생되어야합니다. 복부 척수의 백질에 리소 레시틴 우​​울하게하는 미세 조작기를 사용합니다. 0.5 μL의 최종 부피의 결과로, 2 분 동안 미세 조작기의 1 회전 매 5 초마다 확인합니다. 솔루션의 역류를 방지하기 위해 추가로 2 분 동안 자리에 모세관을두고 조심스럽게 캐 필러를 제거합니다. 척추를 오버​​레이 근육 / 지방 조직에서 하나의 봉합사를 묶어. 피부를 닫습니다 비 중단 된 봉합사를 사용합니다. 절개 사이트에 더 많은 요오드를 적용합니다. 이 복구 될 때까지, 다음의 케이지에 반환 가열 복구 실에서 동물을 놓습니다. 진통제를 적용 포스트에 작동 기관 동물 관리 규정에 따라. 동물이 즉시 마취에서 그들이 복구와 같은 완전히 외래 및 자체 공급 및 음주 할 수있는 등의 추가 수술 후 치료는 일반적으로 필요하지 않습니다. 나머지 동물에 대해이 절차를 반복합니다. 참고 : 구사, 동작은 특히 봉합을 매 두 번째 사람의 도움으로, 동물 당 10-15 분에 완료 될 수있다. 팁이 블런트되고 교체되어야하기 전에 동일한 유리 모세관 15-20 수술에 사용될 수있다. 대신 리소 레시틴의 척수의 PBS로 주입, 제어 된 바와 같이 수술 동일하게 행할 수있다. 우리는 향후 사용을 위해 모세 혈관을 청소하지 않는 것이 좋습니다. 4. 조직 처리 및 분석 목적하는 시점에서 케타민 (500 ㎎ / kg)과 자일 라진 (25 ㎎ / kg)을 복강 내 과용과 희생이. 병변은 일반적으로 foll 진화때문에 방법 : 1 ~ 3 일 활성 탈수 초화; 3~7일, OPC 모집; 7~10일, 희소 돌기 아교 세포의 분화; 10-21일, 활성 재유 수화 2,10,11. 첫 번째 PBS에서 20 ml의 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 다음 20 ㎖ RT PBS로 transcardial 관류 (12)을 수행, 조직 학적 위해 조직을 준비합니다. 반 또는 얇은 절편을위한 수지 포함 된 조직의 준비를위한 단계 4.9을 참조하십시오. 각각의 척추 척추의 자궁 끝에서 시작하여 낮은 흉부 수준까지 작업을 통해 잘라 곡선 뼈 가위를 사용하여 척수를 제거합니다. 4 ° C에서 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 척수 O / N을 수정합니다. 최소 72 시간 동안 4 ° C에서 PBS의 30 % 자당에 코드를 전환합니다. 척수의 등 표면에 이상으로 주사 부위를 확인합니다. (중앙의 주사 부위와) 조직의 3mm 조각을 잘라 최적의 절단 온도를 포함 cryomolds OCT () 공동의 조각을 정렬mpound. OCT를 완전히 고정 될 때까지 2- 메틸 부탄과 드라이 아이스의 냉장 혼합 cryomolds의 아래쪽을 일시 중단합니다. 섹션 전까지 -80 ° C에서 보관하십시오. 현미경 슬라이드 상에 20 ㎛의 폭에서 제 저온 유지 장치에있는 척수 및 건조 공기의 O에 허용 / N -20 ° C에서 슬라이드를 저장하기 전에. 미엘린 (13)의 에리 오 크롬 시아닌 조직 학적 염색을 이용하여 병변의 위치와 크기를 검출한다. 실온에서 모든 단계를 수행합니다. 30 분 동안 공기 건조 슬라이드. 1 분마다 등급 에탄올 솔루션 재수 다음 1 분 (100 %, 95 %, 90 %, 70 %, 50 %, 물)에 대한 에이전트를 제거에 배치 슬라이드. 물에 1 분 세척 한 다음 15 분 동안 에리 오 크롬 시아닌 용액에 넣어 슬라이드. 물에 1 분간 세척 한 후, 10 초 동안 0.5 % 암모늄 하이드 록 사이드에서 차별화. 밝은 필드 마일에서 1 분 장착 미디어와 각, 커버 슬립 및 이미지 (위에서 설명한 순서를 반대로) 등급 에탄올 용액에서 탈수croscope. 축삭과 수초를 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색을 사용합니다. 30 분 동안 공기 건조 슬라이드. RT에서 2 분마다 등급 에탄올 (물, 50 %, 70 %, 90 %, 95 %, 100 %)로 탈수 한 다음 다시 물 역순. 이 단계는 개별 수초 링 (14)의 높은 해상도가 발생합니다. RT에서 60 분 동안 PBS 중 10 %의 염소 혈청과 0.25 %의 트리톤 X-100을 사용하여 비 – 특이 적 항체의 상호 작용을 차단. PBS에서 4 ° C에서 / 슬라이드 O에 N을 품어 차 항체 (1000 : 2000, 토끼 항 MBP 한 마우스 항 – SMI312 1) 희석. RT에서 PBS로 5 분 동안 5 회 반복한다. PBS와 실온에서 60 분 동안 슬라이드에 부화 차 항체 (500 : 500, 알렉사 546 항 – 마우스 1 알렉사 488 항 – 토끼 1) 희석. RT에서 PBS로 5 분 동안 5 회 반복한다. 마운트는 형광 현미경에 gelvatol과 이미지를 사용하여 커버 슬립과 슬라이드. 희소 돌기 아교 세포 계통의 세포를 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색을 사용합니다. 세인트의 절차를 따르십시오EP 4.7, 탈수 / 재수 화 단계를 생략하고, 10 % 말 혈청 대신 염소 혈청을 사용. 다음과 같은 주요 항체 희석을 사용하여 염소 항 – PDGFRα 1 : 100, 마우스 방지 CC1 1 : 200, 토끼 반 Olig2 1 : 200. 알렉사 488 안티 – 염소 1 : 500, 알렉사 594 항 – 마우스 1 : 500, 알렉사 647 항 – 토끼 1 : 500 다음 이차 항체 희석을 사용합니다. 제 20 ㎖ PBS에 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 / 1 % 글루 타르 알데히드이어서 20 ml의 PBS로 RT transcardial 12 관류를 수행 세미 또는 초박 절편을 위해 조직을 제조 하였다. 4.3 단계에 설명 된대로 척수를 제거합니다. 4 ° C에서 PBS에서 O / N 4 %에서 파라 포름 알데히드 / 1 % 글루 타르 알데히드를 수정합니다. 단계 4.4에 설명 된대로 주사 부위를 확인합니다. 주사 부위를 포함하는 조직의 1mm 조각을 잘라. 필요한 경우 병변의 양쪽에 추가 1mm 블록은 또한 제조 될 수있다. 흄 후드에서 얼음에 각각의 블록에 10 배량의 1 % 오스뮴 테트 록 사이드 / 1.5 %의 황 혈염을 추가60 분. 참고 : 오스뮴 테트 록 사이드는 독성이 강한 물질이며 특히주의해서 처리해야합니다. 산화 오스뮴과 접촉하는 모든 물질 중화 옥수수 유 (산화 오스뮴 용액 배 부피)에 배치되어야한다. 옥수수 기름에 폐기, 실온에서 10 분 동안 0.2 M cacodylate로 코드를 제거하는 과정을 3 회 반복한다. 등급 에탄올 용액 (물, 50 %, 70 %, 90 %, 95 %로 2 회, 100 %의 2 배, 프로필렌 옥사이드 2 회) RT에서 10 분 동안 함께 탈수. 제조업체의 지침에 따라 수지에 포함 된 코드. 을 Ultramicrotome에 블록을 잘라 현미경 슬라이드에 물방울 위에 섹션을 탑재합니다. 건조까지 핫 플레이트 (약 50 ° C)에 배치 슬라이드. 50 ℃에서 10-15 초 동안 슬라이드에 푸른 톨루이딘 1 % / 2 % 붕사 용액 몇 방울을 첨가하여 미엘린 시각화. 설치 매체와 물, 건조 및 커버 슬립 씻어. 밝은 필드 현미경 이미지 섹션.