Protocoles pour l'obtention Zygotic et embryons somatiques pour l'étude de la réglementation de développement précoce de l'embryon dans la légumineuse modèle<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
Embryogenèse précoce partir d'un seul zygote cellulaire passe par division cellulaire rapide et de la morphogenèse, et est morphologiquement caractérisée par étapes de pré-globulaire, globulaires, cardiaques, lance-torpilles et cotylédons. Ce développement progressif est sous la stricte réglementation d'un réseau moléculaire complexe. La récolte des embryons précoces suffisantes à un stade de développement similaire est indispensable pour étudier la régulation cellulaire et moléculaire de l'embryogenèse précoce. Cela ne veut pas simple puisque l'embryogenèse précoce subit morphogenèse rapide dans un temps court, par exemple 8 jours pour Medicago truncatula pour atteindre le stade cotylédons tôt. Ici, nous abordons la question par deux approches. Le premier établit un lien entre le développement de l'embryon et pod morphologie en aidant indiquer le stade de l'embryon zygotique. Ceci est en particulier basée sur le nombre de spires et le développement des épines pod. Une autre manière de compléter in vivo ses études est via explants culture de feuilles pour produire des embryons somatiques. Le milieu comprend une combinaison d'hormones inhabituelle – une auxine (acide 1-naphtalène), une cytokinine (6-benzylaminopurine), l'acide abscissique et l'acide gibbérellique. Les différentes étapes peuvent être discernées plus en plus hors du cal sans dissection.
Introduction
Les légumineuses sont la troisième plus grande famille de plantes supérieures avec environ 20.000 espèces et des légumineuses (ou fabacées) de la famille sont en second lieu à céréales de la superficie récoltée et la production totale 1. Le soja est la troisième plus grande plante cultivée. Les légumineuses à grains fournissent environ un tiers des protéines alimentaires, et un tiers d'huile végétale pour la consommation humaine 2. Légumineuses avec leur capacité de fixation de N 2 contribuent également à des systèmes agricoles durables. Medicago truncatula, comme le soja, les magasins protéines et d'huile dans les cotylédons de ses graines et est un modèle de légumineuses génétique et génomique des ressources génétiques et génomiques considérables 3,4. Alors que M. truncatula a permis des avancées dans la compréhension de la symbiose Rhizobium-légumineuses 4 il a été de plus en plus utilisé pour étudier la biologie des semences de légumineuses 5-7 et de l'embryogenèse 8,9. Arabidopsis embryogenèse a été largement étudiée 10,11 mais il isa non-légumineuses et les détails de l'embryogenèse ne sont pas identiques à Medicago 8,10. Embryogenèse zygotique dans M. truncatula a des caractéristiques intéressantes, avec un hypophyse multicellulaire distinctif, un suspenseur endoployploid et la cellule de transfert de base 8.
L'embryogenèse somatique (SE) est couramment utilisé pour 12 régénérer des plantes. Dans le modèle de légumineuse M. truncatula, la ligne de semis Jemalong 2HA (2HA) a été développé à partir du parent Jemalong d'avoir des taux élevés de l'embryogenèse somatique 13. Le nombre d'embryons produits a récemment été substantiellement augmentée en ajoutant à la fois acide gibbérellique (GA) et de l'acide abscissique (ABA) dans le milieu depuis longtemps établi 14. Dans ce cas, GA et ABA agissent en synergie, ce qui est inhabituel étant donné que GA et ABA agissent généralement antagoniste 14. Les embryons produits à partir de cals se développent sur la surface qui permet à l'étape de l'embryogenèse à être facilement déterminée Visually et facilement récolté. Avoir à proximité des lignes isogéniques qui sont embryonnaires (2HA) et non-embryonnaire (Jemalong) facilite l'enquête de l'embryogenèse somatique et ayant à la fois in vivo et in vitro fournit des systèmes de différentes possibilités expérimentales.
Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement embryonnaire est essentiel pour la compréhension des semences et le développement des plantes. Dans les légumineuses, comme dans les autres dicotylédones, ce sont les cotylédons de l'embryon qui stockent les produits qui sont utilisés pour la nutrition humaine. Embryogenèse précoce implique la division cellulaire rapide, et la structuration de l'embryon correcte. Dans environ 8 jours après la fécondation, l'M. truncatula embryon atteint stades cotylédons début. La caractérisation morphologique est pas exactement indiquée par jours après la fécondation dans des conditions de serre. Ainsi, une approche efficace normalisé pour indiquer le stade de développement des embryons est précieux dans l'étude de la génétique regulation du début de l'embryogenèse zygotique.
Dans cet article, nous proposons deux protocoles normalisés afin de recueillir des embryons en développement pour les études biologiques de l'embryogenèse dans la légumineuse modèle M. truncatula. Le premier est de collecter des embryons zygotiques en associant l'embryogenèse et pod morphologie tandis que le second est l'embryogenèse somatique par culture des explants de feuilles de fournir un grand nombre d'embryons facilement accessibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits sont relativement simples et permettent enquête de l'embryogenèse légumineuses avec toute la cellule contemporaine et des techniques moléculaires. Nous reconnaissons qu'il ya des avantages et des inconvénients des deux in vivo et in vitro approches. Les deux permettent davantage l'accent sur l'embryogenèse précoce par rapport à la culture des graines immatures 19.
Dans le cas des études in vivo ce qui est dé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula – implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
