Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryo's voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
Vroege embryogenese uitgaande van een enkele cel zygote doorloopt snelle celdeling en morfogenese, en wordt morfologisch gekenmerkt door pre-bolvormige, bolvormig, hart, torpedo en cotyledon fasen. Deze geleidelijke ontwikkeling is onder de strakke regulering van een complexe moleculaire netwerk. Oogsten voldoende vroege embryo's in een soortgelijk stadium van de ontwikkeling is van essentieel belang voor het onderzoek naar de cellulaire en moleculaire regulatie van de vroege embryogenese. Dit is niet eenvoudig omdat de vroege embryogenese ondergaat snelle morfogenese in korte tijd bijvoorbeeld 8 dagen voor Medicago truncatula aan het begin van de zaadlob stadium te bereiken. Hier pakken we het probleem op door twee benaderingen. De eerste wordt een koppeling tussen embryonale ontwikkeling en pod morfologie helpen geven de fase van de zygotische embryo. Dit is met name gebaseerd op het aantal pod spiralen en de ontwikkeling van de stekels. Een alternatieve manier om een aanvulling op de in vivo studies is via kweken bladexplantaten somatische embryo's. Het medium omvat een ongewone combinatie hormoon – Een auxine (1-naftaleenazijnzuur), een cytokinine (6-benzylaminopurine), abscisinezuur en gibberellinezuur. De verschillende stadia te onderscheiden groeien uit de eelt zonder dissectie.
Introduction
Peulvruchten zijn de derde grootste familie van hogere planten met ongeveer 20.000 soorten en de vlinderbloemigen (of Fabaceae) familie zijn tweede granen in geoogste oppervlakte en de totale productie 1. Soja is de derde grootste gecultiveerde gewas. Peulvruchten geven ongeveer een derde van eiwitten en een derde van plantaardige spijsolie 2. Peulvruchten met hun N 2 vaststellen capaciteit ook bijdragen aan duurzame landbouwsystemen. Medicago truncatula, zoals soja, winkels eiwit en olie in de zaadlobben van de zaden en het is een genetische en genomische peulvruchten model met een aanzienlijke genetische en genomische hulpbronnen 3,4. Terwijl M. truncatula heeft vooruitgang mogelijk in het begrijpen van de peulvruchten-Rhizobium symbiose 4 het is in toenemende mate gebruikt om zaad van vlinderbloemigen biologie 5-7 en embryogenese 8,9 bestuderen. Arabidopsis embryogenese is uitgebreid bestudeerd 10,11 maar iksa niet-vlinderbloemige en de details van de embryogenese niet identiek zijn aan Medicago 8,10. Zygotische embryogenese in M. truncatula heeft interessante functies, met een onderscheidend meercellige hypofyse, een endoployploid suspensor en basale overdracht cel 8.
Somatische embryogenese (SE) wordt vaak gebruikt voor het regenereren van planten 12. In de peulvruchten model M. truncatula, het zaad lijn Jemalong 2HA (2HA) is ontwikkeld vanuit de ouder Jemalong om hoge tarieven van somatische embryogenese 13 hebben. Het aantal embryo's is onlangs inhoudelijk verhoogd waarbij zowel gibberellinezuur (GA) en abscisinezuur (ABA) op de lang bestaande medium 14. In dit geval GA en ABA daad synergetisch, wat ongebruikelijk is gezien het feit dat Georgië en ABA meestal antagonistisch 14 treden. De hoeveelheid uit callus embryo ontwikkeld op het oppervlak waarmee het stadium van embryogenese gemakkelijk te bepalen Visually en snel geoogst. Met buurt isogene lijnen die embryogene (2HA) en niet-embryogene (Jemalong) zijn vergemakkelijkt het onderzoek naar somatische embryogenese en met zowel in vivo als in vitro systemen biedt verschillende experimentele mogelijkheden.
Het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van embryonale ontwikkeling is essentieel voor het begrijpen zaden en ontwikkeling van de plant. In peulvruchten, zoals in andere dicotylen is de zaadlobben van het embryo dat de producten die worden gebruikt voor menselijke voeding slaan. Vroege embryogenese impliceert snelle celdeling, en de juiste embryo patroonvorming. Ongeveer 8 dagen na de bevruchting, de m truncatula embryo bereikt zaadlob vroeg stadium. De morfologische karakterisering is niet precies aangegeven dagen na de bevruchting in de kas omstandigheden. Aldus wordt een efficiënte standaardbenadering het stadium van ontwikkeling van embryo geven waardevol in het bestuderen van de genetische Regulatie van de vroege zygotische embryogenese.
In dit artikel geven we twee gestandaardiseerde protocollen voor de ontwikkeling van embryo's voor biologische studies van embryogenese te verzamelen in de peulvruchten model M. truncatula. De eerste is om zygotische embryo's te verzamelen door het te associëren embryogenese en pod morfologie, terwijl de tweede is somatische embryogenese via kweken bladexplantaten te gemakkelijk bereikbaar grote aantallen embryo te bieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven protocollen zijn relatief ongecompliceerd en laat onderzoek van peulvruchten embryogenese met alle hedendaagse cel en moleculaire technieken. We erkennen dat er voordelen en nadelen van zowel in vivo en in vitro methoden. Beide kunnen meer nadruk op de vroege embryogenese in vergelijking met de cultuur van onrijpe zaden 19.
Voor in vivo studies wat beschreven is hoofdzakelijk het isoleren van de eicel van de huls die geschikt is voor veel e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula – implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
