Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering
Summary
Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Abstract
Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMS) hebben een belangrijke bron van cellen aan het ontbreken van primaire cardiomyocyten beschikbaar voor fundamenteel onderzoek en translationeel toepassingen pakken geworden. Om hiPSCs naar cardiomyocyten onderscheiden, zijn verschillende protocollen, waaronder embryoid body (EB) gebaseerde differentiatie en groeifactor inductie ontwikkeld. Echter, deze protocollen zijn inefficiënt en zeer variabel in hun vermogen om gezuiverd cardiomyocyten genereren. Onlangs heeft een klein molecuul gebaseerd protocol gebruik te maken van modulatie van de Wnt / β-catenine signalering werd aangetoond dat cardiale differentiatie met een hoge efficiëntie te bevorderen. Met dit protocol, meer dan 50% -60% van de gedifferentieerde cellen waren troponine-positieve hartspiercellen werden consistent waargenomen. Voor een nog grotere zuiverheid cardiomyocyten werden de gedifferentieerde cellen blootgesteld aan glucose honger specifiek elimineren niet- cardiomyocyten gebaseerd op de metabolische verschils tussen cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten. Met deze selectie strategie, we consequent een toename van meer dan 30% in een verhouding van hartspiercellen op niet- cardiomyocyten als een populatie van gedifferentieerde cellen verkregen. Deze zeer gezuiverde hartspiercellen moet de betrouwbaarheid van de resultaten uit menselijke iPSC-gebaseerde in vitro ziekte modelstudies en screeningstesten voor geneesmiddelen te verbeteren.
Introduction
Primaire menselijke cardiomyocyten moeilijk te verkrijgen vanwege de vereiste invasieve cardiale biopsies moeilijk dissociëren tot enkele cellen, en vanwege de slechte lange termijn overleving van de cel in kweek. Gezien dit gebrek aan primaire menselijke hartspiercellen, patiënt-specifieke humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyte (iPSC-CM) technologie is beschouwd als een krachtig alternatief cardiomyocyte bron voor fundamenteel onderzoek, evenals klinisch en translationeel toepassingen zoals de ziekte van modellering en drugs discovery 1. Vroege pogingen in differentiërende pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten toegepast differentiatie protocollen met embryo lichamen (EB's), maar deze methode is inefficiënt produceren cardiomyocyten omdat vaak minder dan 25% van de cellen in een EB zijn slaan cardiomyocyten 2,3. Relatief, een monolaag gebaseerde differentiatie protocol met de cytokines activine A en BMP4 vertoonde een hoger rendement dan EBS, maarDit protocol is nog relatief inefficiënt, vereist kostbare groeifactoren en werkt alleen in een beperkt aantal humane pluripotente stamcellijnen 4. Onlangs werd een zeer efficiënte, iPSC monolaag gebaseerde hartspierceldifferentiatie protocol ontwikkeld door moduleren Wnt / β-catenine signalering 5. Deze iPSC-CM's te uiten troponine T en alpha actinine, twee sarcomeer eiwitten die standaard markers van hartspiercellen 6 zijn. Het protocol beschrijft hier is een aanpassing van deze kleine moleculen gebaseerde, feeder cel-vrij, monolaag differentiatie methode 5,7. Wij zijn in staat om te verkrijgen verslaan hartspiercellen uit hiPSCs na 7-10 dagen (figuur 1). Overeenkomstig een hartspierceldifferentiatie resulteert in 50% verslaan cellen consistent immunokleuring blijkt dat er een populatie van niet- cardiomyocyten die negatief voor cardiomyocyt- specifieke merkers zoals cardiaal-specifieke troponine T en alfa-actinine zijn. Om further zuiveren cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten elimineren, werden heterogene gedifferentieerde celpopulaties blootgesteld aan honger glucose door ze te behandelen met een extreem lage glucose kweekmedium voor meerdere dagen (figuur 2). Deze behandeling selectief kunnen de niet-cardiomyocyten wegens het vermogen van cardiomyocyten, maar geen niet-cardiomyocyten, lactaat als primaire energiebron metaboliseren om te overleven in een lage glucose omgeving 8. Na deze zuiveringsstap wordt een 40% toename in de verhouding van hartspiercellen op niet- cardiomyocyten waargenomen (Figuur 3, Figuur 4) en deze cellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse genexpressie analyse, ziektemodel en screeningstesten voor geneesmiddelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het verkrijgen van een grote hoeveelheid zeer zuivere-iPSC afgeleide cardiomyocyten cruciaal voor fundamenteel cardiale onderzoek als klinische en translationele toepassingen. Cardiale differentiatie protocollen enorme verbeteringen ondergaan in de afgelopen jaren, overgang van embryoid body gebaseerde werkwijzen die gebruik cardiogene groeifactoren 2, sandwich werkwijzen 12 matrix, en uiteindelijk naar kleine moleculen gemoduleerd en monolaag-gebaseerde methoden 5. Van de bovengenoemde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
| DMSO | Sigma | D-2650 |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
| IWR1 | Sigma | I0161 |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
| Accutase | Millipore | SCR005 |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
