Долгосрочная прижизненные Многофотонная микроскопия изображений иммунных клеток в здоровых и больная печень Использование CXCR6.Gfp Reporter Мыши

Визуализация клеток и клеточных функций в целых органов или даже целых организмов был большой интерес для более чем 50 лет, в том числе практически во всех частях тела ^2. Таким образом, некоторые ранние исследования уже используются прижизненной визуализации печени ^3,4. Тем не менее, существуют некоторые ограничения в курсе относительно долгосрочного стабильного изображений с высоким разрешением ткани печени.

Из-за анатомическом положении печени в тесном контакте с мембраной и желудочно-кишечного тракта ^5, наиболее распространенной проблемой для микроскопического прижизненной визуализации это движение за счет дыхания и, в меньшей степени, перистальтические из желудочно-кишечного тракта ^6. По сравнению с другими твердыми органов, хирургия печени является чрезвычайно сложным. Из-за плотной структуры микрососудов, хирургических манипуляций может привести к массовым поражением геморрагических, нарушение микроциркуляции ^7, а также активацию резидента яmmune клетки, такие как клетки Купфера ^8. Таким образом, механическая фиксация ткани, опубликованы в другом месте ^6,9, скорее всего, вмешиваться в прижизненной визуализации микроскопии.

В здоровой печени, 10-15% от общего объема крови находится в пределах сосудистой печени, и орган получает около 25% от общего сердечного выброса ^10, что делает орган очень чувствительны к изменениям в обращении (например, колебания артериального давления ). Таким образом, сбои в печеночного кровотока, обусловленная, например, напряжение сдвига, смещения, травмы чрезмерной обработки тканей или централизованного обращения приведет к искусственным изменениям в лейкоцитарной миграционного поведения, нарушение оксигенации печени и поэтому дальнейшего повреждения печени, поражающими печень иммунный ответ, а также как сохранение органов и общего времени жизни животного.

Ранние микроскопические исследования были основаны на прижизненных эпифлуоресцентной мимикроскопия, но некоторые технические ограничения, такие как фото отбеливания и низкой глубины проникновения ограничить использование этого метода для долгосрочного изображений печени ^4,11,12. С развитием МФ микроскопии в 1990-х годах, ограничения фото отбеливания или глубины проникновения в основном решена, так как это новый метод был технически способна выполнять исследования изображений практически во всех органах в реальных жизненных ситуациях ^13-15. Тем не менее, основные нерешенные проблемы в отношении визуализации печени были: движения дыхания, автофлуоресценции ткани печени, обеспечения неизменном кровоток в печени синусоид и особенно стабильное изображение в течение длительного периода нескольких часов ^16.

Хотя некоторые исследования имя функции и миграцию различных лейкоцитов в печени ^17, например, NKT-клетки ^18-20, Т-клетки ^21,22, макрофаги печени ^23,24 или нейтрофилы ^25, долгосрочные многофотонное мicroscopy изображений еще не было успешно установлено, задача еще более сложная у животных с острой или хронической болезни печени в связи с существующей повреждения и поэтому более высокая чувствительность к дальнейшему повреждению ^26. Однако мониторинг миграционное поведение и функцию клеток лейкоцитов в печени в режиме реального времени позволяет новый взгляд в их конкретной роли в гомеостазе заболевания печени и ^27.

CXCR6 хемокинов рецептор экспрессируется на несколько подмножеств лимфоцитов, в том числе естественных киллеров (NK) клеток, НКТ-клеток и некоторых популяций Т-клеток ^18,28. Предыдущие исследования на мышах показали, что CXCR6 и его родственный лиганд CXCL16 может управлять патрулирование НКТ-клеток на синусоиды печени во время гомеостаза. Следовательно, использование мышей CXCR6.gfp (несущий детонации-ин зеленого флуоресцентного белка [GFP] в локусе CXCR6) был описан исследовать миграцию лимфоцитов в различных органах, таких как мозг ²⁹а также печень ^18,20, показав увеличилось проникновение CXCR6.gfp клеток на воспаление.

С помощью способа, представленной в данном исследовании можно было выполнить следующие процессы в течение длительного периода времени при стабилизированных условиях. Прижизненный процедура, основанная многофотонное разрешается изображений, который был хорошо воспроизводимым с минимальным возмущением животного и органа; оптимизирована для долгосрочного выживания животного расширенного мониторинга с последующим тщательным контролем дыхания и кровообращения; и очень гибкий и легко принять и для других паренхиматозных органах, таких как почки или селезенки.