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신경과학

Imaging Ca<sup> 2+</sup> Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Published: May 06, 2015
doi:
10.3791/52588
, , , , ,
1Institute for Ophthalmic Research,University of Tübingen, 2Graduate School of Cellular & Molecular Neuroscience,University of Tübingen, 3Bernstein Centre for Computational Neuroscience,University of Tübingen, 4Molecular Genetics Laboratory,University of Tübingen, 5Centre for Ophthalmology,University of Tübingen

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll, um Ca 2+ Dynamik in den Axonterminalen von Zapfen-Photorezeptoren mit einem ex-vivo Scheibe Vorbereitung der Maus Netzhaut zu überwachen. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Studien der Kegel Ca 2+ Signalisierung in einem wichtigen Säugetiermodellsystem der Maus.

Abstract

Netzhaut-Zapfen-Photorezeptoren (Kegel) dienen Tageslicht Vision und sind die Basis für Farbunterscheidung. Sie unterliegen Degeneration, oft zur Erblindung führen in vielen Netzhauterkrankungen. Calcium (Ca 2+), ein wichtiger sekundärer Botenstoff bei Photorezeptorsignalisierung und Stoffwechsel, ist vorgeschlagen worden, indirekt mit Photorezeptordegeneration in verschiedenen Tiermodellen verknüpft werden. Systematische Studium dieser Aspekte Konus Physiologie und Pathophysiologie von den Schwierigkeiten bei der elektrischen Aufzeichnen von diesen kleinen Zellen, insbesondere in der Maus, wo der Netzhaut wird von Stäbchen-Photorezeptoren dominiert behindert. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir ein Zwei-Photonen-Ca 2+ Bildgebungsprotokoll unter Verwendung eines transgenen Mauslinie, die den genetisch kodierten Ca 2+ Biosensor TN-XL drückt ausschließlich in Kegel und kann mit Maus-Modellen für Photorezeptordegeneration gekreuzt werden. Das hier beschriebene Protokoll ist die Vorbereitung vertikalen Abschnitte (R20; Scheiben ") der Netzhaut von Mäusen und optische Bildgebung von Lichtreiz hervorgerufene Veränderungen der Kegel Ca 2+ Ebene. Das Protokoll ermöglicht auch "in-Slice-Messung" der absolute Ca2 + Konzentrationen; wie die Aufnahmen können durch Kalibrierung. Dieses Protokoll ermöglicht Studien zu funktionellen Eigenschaften Kegel und wird voraussichtlich bis zum Verständnis der Kegel Ca 2+ Signalisierung sowie die mögliche Beteiligung von Ca 2+ in Photorezeptor Tod und Netzhautdegeneration bei.

Introduction

Vision beginnt mit der lichtinduzierten Aktivierung der Phototransduktionskaskade in retinalen Photorezeptoren. Stäbchen-Photorezeptoren erlauben Sicht bei schlechten Lichtverhältnissen, während die Zapfen-Photorezeptoren vermitteln Farben und hochauflösende Tageslicht Vision. Viele Photorezeptor-spezifische Gene sind anfällig für Mutationen, die zur Degeneration dieser Zellen führen. Eine Anzahl von molekularen Markern mit Photorezeptorverlust ermittelt wurden 1, aber bis jetzt die detaillierte molekulare Mechanismen und die Abfolge der Ereignisse unklar bleiben. Verändert Ca 2+ Homöostase wurde spekuliert, ein Ansprechen der Fotorezeptor Zelltod, eine Hypothese durch die Hochregulierung der Aktivität der Ca 2+ -abhängigen Calpain-Proteasen während der Degenerationsprozess 2,3 unterstützt werden. Allerdings sind bisher diese Hypothese nicht durch physiologische Messungen von Ca 2+ gesichert. Inkonsistenzen in mehreren Studien über die Wirkung von Ca 2+ -Kanal-Blockern bei der WiederDarm-Erkrankungen weiter in Frage gestellt, die Beteiligung von Ca2 + in den Zelltod 4-6, fordern Methoden, um direkt zu bewerten Ca 2+ in Säugetier-Zapfen-Photorezeptoren.

Bisher haben die meisten elektrischen Aufzeichnung und Ca 2+ Bildgebungsstudien in Amphibien- und Reptilien Modelle wegen der leichteren Zugang zu Kegel 7-9 durchgeführt. Jedoch können Säugerphysiologie Photorezeptor unterscheidet sich von Nichtsäugern 10 und speziell zu sein, im Rahmen der menschlichen erblichen retinalen Degeneration, ist ein besseres Verständnis der Säugerphysiologie Photorezeptor ein Schlüssel für die Entwicklung von innovativen Behandlungen. Viele Mausmodelle imitieren menschlichen Netzhauterkrankungen sind vorhanden, aber wenig über Ca 2+ Dynamik in der Maus Kegel 11 bekannt. Elektrische Techniken sind nicht geeignet für Hochdurchsatz-Aufnahmen von Zapfen, insbesondere nicht in Mäusen, denen Stangen (~ 97%) deutlich übertreffen Zapfen (~ 3%) 12 </sup>. Darüber hinaus sensible elektrophysiologischen Techniken wie Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen stören das intrazelluläre Milieu und liefern Daten über Ca 2+ Ströme aber nicht auf absolute intrazelluläre Ca2 + Konzentrationen. Daher trotz der geringeren zeitlichen Auflösung, Bildgebung ist die Methode der Wahl, wenn es um Fragen rund um Kegel Ca 2+ Dynamik. Die zentrale Frage ist, wie mit bildgebenden, selektiv zu kennzeichnen die Kegel mit einem fluoreszierenden Ca 2+ Indikatorfarbstoff. Ordnungsgemäße Kompartimentierung und Zellspezifität ist schwer zu erreichen, indem "bulk-loading" synthetische Ca 2+ Indikatorfarbstoffe in das Gewebe. Als Folge markiert Kegel, Stäbe 13,14 und Müller Gliazellen nicht verlässlich unterschieden werden. Auch neigen synthetische Farbstoffe aus den Zellen austreten, verhindert verlängert Aufnahmen unter konstanten Bedingungen. Weiterhin Laden synthetischen Ca 2+ Indikatoren in ihren AM-Esterform ist problematisch, da es erfordert, detergents (zB DMSO) und erzeugt Formaldehyd 15. Für absolute Ca 2+ Messungen sind ratiometrische Indikatoren Pflichtfelder. Allerdings ist die beste zur Zeit erhältlichen synthetischen ratiometrischen Indikator Fura-2 erfordert Anregungslicht im Bereich von 700 bis 760 nm (für die Zweiphotonenanregung), die in Abhängigkeit von ihrer Intensität, kann in sich selbst stimulieren die Zapfen und damit ein Hindernis für Untersuchungen von Kegel Ca 2+ Dynamik unter physiologischen Beleuchtungsbedingungen.

Im Gegensatz zu synthetischen Farbstoffe können genetisch kodierten Ca 2+ Indikatoren in einem Zelltyp selektiv exprimiert werden. Sie nicht auslaufen aus den Zellen, und deshalb, wenn die Bleiche zu vermeiden, sind lange und zuverlässige ratiometrische Messungen. Zelltyp-selektive Expression des Ca 2+ Biosensoren, wenn sie mit Zwei-Photonen-Mikroskopie in Kombination stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um unter physiologischen Bedingungen weitgehend 13,16,17 zu bewerten und zu studieren subzellulärer Ca2 + </sup>. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Lichtreiz hervorgerufene Kegel Ca 2+ Dynamik zu studieren in einem transgenen Ca 2+ Biosensor Mauslinie (HR2.1: TN-XL), die die FRET-Ca 2+ Biosensor TN-XL 18 drückt selektiv in Kegel, unter der menschlichen roten Opsin-Promotor HR2.1 19. Um die Kegel-Terminals zugreifen zu können, wurde ein Ex-vivo Schnittpräparat 20 verwendet. Das Protokoll wurde bereits erfolgreich in drei Studien über Kegelfunktion in gesunden Mäusen 10,21,22 verwendet. Darüber hinaus ist die Protokoll ermöglicht das Studium Kegel Ca 2+ Signal in spezifischen genetischen Bedingungen, beispielsweise durch Kreuzung Mausmodelle für erbliche Netzhautdegeneration mit HR2.1: TN-XL-Mäusen.

Protocol

Alle tierischen Verfahren wurden auf die Richtlinien und Gesetze für den Tierschutz von Bundesregierung festgelegt und vom institutionellen Tierschutzkomitee der Universität Tübingen genehmigt Einhaltung durchgeführt. 1. Tiermodelle HR2.1: TN-XL Ca 2+ Biosensor Maus Verwenden Sie den transgenen HR2.1: TN-XL Mauslinie, die den Ca 2+ Biosensor TN-XL selektiv in Zapfen-Photorezeptoren 10. Verwenden Sie 3-6 Wochen alt Mäusen beiderlei Geschlechts mit einem Standard 12 Stunden Tag / Nacht-Rhythmus erhöht. 2. Retinal Dissection Physiologischen Lösung Frisch herstellen 2 l extrazellulären Lösung, enthaltend 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, 0,5 mM L-Glutamin und 20 mM (+) Glucose. Mischen Sie, bis alle Bestandteile aufzulösen. "Bubble" extrazellulären Lösungmit carboxygen (95% O 2, 5% CO 2) für 5 – 10 min. Hinzuzufügen CaCl 2 in einer Konzentration von 2 mM zu erreichen. Nach dem Einblasen des extrazellulären Lösung, deren pH-Wert zu messen. Der pH-Wert sollte 7,4, andernfalls ist es wahrscheinlich, dass Fehler sind während der Herstellung der Lösung vorgenommen. Halten Sie sprudeln Rate und Lösungstemperatur konstant im gesamten Experiment zu konstanten pH-Wert zu gewährleisten. Trennen Sie die Lager in 2 Flaschen, eine für Netzhaut-Dissektion und eine für die Aufnahme-Setup (Perfusion). Eye Enukleation und Isolierung von Netzhaut (5 – 10 min) Achten Sie auf eine trübe rote Beleuchtung im Arbeitsbereich für die Enukleation. Verwenden Leuchtdioden mit einer Spitzenwellenlänge von 650 nm (oder länger), um die Bleich von Zapfen beim Präparieren vermeiden. Dark-Anpassung die Maus für 2 Stunden, indem sie seinem Käfig in einem gut belüfteten, lichtdichten Kasten, um sicherzustellen, dass Kegel vollständig zum Zeitpunkt der Aufnahmen sensibilisiert. Betäuben die Maus unter einem Laboratory Kapuze mit Isofluran (5%) mit einem Verdampfer und einem gasdichten Behälter, der eine Standardmaus Käfig hält. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers beim Umgang mit dem Verdampfer. Verwenden Sie Handschuhe und Gesichtsmaske, um die Exposition gegenüber Allergenen zu reduzieren. Verwenden Sie ein Binokular mit einer 10 – 40-facher Vergrößerung für die Präparation. Opfer der narkotisierten Maus durch Enthauptung. Zur Orientierung, markieren Sie die Spitze jedes Auge (= dorsal) mit einem wasserfesten Stift. Behalten Sie den Überblick, ob mit linke oder rechte Auge. Entfernen Sie die Augen sorgfältig mit einer gebogenen Schere durch Abschneiden der Sehnerv hinter dem Augapfel. Für die Präparation, überweisen Sie den Augapfel in eine Petrischale mit frisch carboxygenated extrazellulären Lösung. Zur Übertragung des Augapfels, halten Sie es an den Sehnerv Stumpf. Durchbohren das Auge an jedem Punkt entlang der Grenze zwischen der Hornhaut und der Lederhaut (dh an der Ora serrata) mit einem scharfen Injektionsnadel. Halten Sie die eihr bei der Lederhaut mit einer Zange und schieben Sie eine Schere Klinge in das Loch in der vorherigen Schritt gemacht. Entlang der Ora serrata geschnitten, um den vorderen Teil des Auges (Hornhaut, Linse, Glaskörper) aus dem hinteren Teil (Augenmuschel) zu trennen. Schneiden Sie die Augenmuschel radial (in Richtung der Papille) an der Position des Stiftes Zeichen, um die Rückenlage auf der Netzhaut zeigen. Hinweis: Vorbereitet auf diese Weise, die Augenmuscheln in ständig carboxygenated Lösung für den späteren Gebrauch aufbewahrt werden. Drehen Sie die Augenmuschel in der Petrischale, so dass die Rücken schneiden Punkte weg von sich selbst. Besorgen Sie sich die Lederhaut auf der linken und der rechten Seite der Augenmuschel mit einer Pinzette jeweils durch Einsetzen der Zangenspitzen zwischen Netzhaut und Lederhaut. Trennen Sie die Netzhaut durch vorsichtiges Umdrehen der skleralen Teil der Augenmuschel. Schließlich schneiden den Sehnerv mit Mikro Präparierscheren, um die Netzhaut von der Lederhaut zu befreien. Anmerkung: Dies ist ein kritischer Schritt. Schädigung der Netzhaut (beispielsweise durch Vermeidung vonberührend und drückte sie mit einer Pinzette). Halten eines der Ränder der Netzhaut mit einer Pinzette und sanft Trümmer und Glaskörper zu entfernen von der Retinaoberfläche unter Verwendung einer zweiten Zange. Wenn der Netzhautoberfläche sauber ist, verwenden Mikro Präparierscheren zu drei weitere kürzere, radiale Einschnitte (etwa alle 90 °) zu machen. Diese Schnitte erlauben es, sorgfältig glätten die Netzhaut mit der Photorezeptor Seite nach unten in der Petrischale (Abbildung 1A). Scheibe Vorbereitung (10-15 min) Bereiten Sie vorher Nitrocellulosefilter-Membranen für die Netzhaut Schneiden und Glasdeckgläschen für die Montage Scheiben und ihre Übertragung auf die Aufnahme Kammer. Schneiden Sie Nitrocellulosefilter-Membran in etwa 10 x 5 mm große rechteckige Stücke mit einer Schere. Schneiden Sie Deckgläser in etwa 10 x 5 mm große rechteckige Stücke mit einem Glasschneider. Langsam tauchen ein Glasobjektträger in die extrazelluläre Lösung in der Nähe vonGewebe. Sanft, ziehen Sie die Netzhaut auf den Objektträger mit der Ganglienzellseite nach oben durch Greifen sie am Rand mit einer Pinzette. Dieser Prozess reduziert mechanische Beschädigungen und Faltung von Gewebe. Den Bereich der Netzhaut, die auf die jeweilige Fragestellung bezieht wählen (siehe auch Diskussion). Denken Sie daran, die langen Schnitt in Schritt 2.2.9 gemacht markiert die dorsale Hälfte der Netzhaut (Abbildung 1A). Geschnitten einen rechteckigen, etwa 1 x 2 mm großes Stück aus dem ausgewählten Netzhautbereich mit einer gekrümmten Skalpellklinge. Wischen Sie überschüssiges Lösung um das Gewebe. Die Filtermembran oben auf dem Stück der Netzhaut, so dass die Ganglienzellseite an der Membran haftet. Sofort, einen Tropfen extrazelluläre Medium auf die Membran fest eingesteckt das Gewebe zur Membran. Übertragen Sie die Membran angebrachte Netzhautgewebe an der Schneidekammer mit frischem extrazellulären Lösung. Schneiden Sie Netzhaut in senkrechte Scheiben von 200 & mgr;Dicke (1B) unter Verwendung eines frischen Rasierklinge an ein Gewebe Chopper 23 befestigt. Ändern Klinge für jeden Netzhautstück. Hinweis: Die Rasierklinge muss perfekt mit der Oberfläche des Schneidkammerboden ausgerichtet werden, so dass die gesamte Membran teilt gleichzeitig, wie durch ein "Klick" Ton beim Schneiden – sonst die Klinge zu biegen und die Scheibe beschädigen. Kleben Sie eine einzelne Membran angebrachte Scheibe auf eine Glasdeckglas, indem Hochvakuumfett auf die Membran endet erst (Abbildung 1c). Halten Sie die Glasoberfläche unter der Netzhaut frei von Fett. Halten Deck montierten Scheiben durch einen Tropfen extrazellulären Lösung in der Aufnahmekammer bedeckt – einen geschlossenen und lichtdichten Behälter, beispielsweise eine Petrischale mit dem Deckel abgedeckt mit Aluminiumfolie – unter einem carboxygen Atmosphäre bei RT. Einzuführen carboxygen durch Blasenbildung einen kleinen Wasserbehälter, um die Atmosphäre in der Halte haltenKammer befeuchtet; dies verhindert, dass die Scheiben vor dem Austrocknen. Lassen Sie Scheiben in der Haltekammer 10 ruhen – 15 min, bevor sie (eine nach der anderen) in die Aufnahme Kammer. Slices kann bis zu 4-5 Stunden in Haltekammer bei Raumtemperatur gehalten werden (~ 21 ° C). 3. Zwei-Photonen-Imaging Ca 2+ Zwei-Photonen-Mikroskopie Verwenden Sie ein Movable Objective-Mikroskop (MOM) -Typ Zwei-Photonen-Mikroskop. Beide MOM Design und bildgebenden Verfahren wurden zuvor 24 beschrieben, für Details siehe auch 10,21,25 (für Quellen und Firmen, siehe Tabelle 1). Hinweis: Jede aufrechte Zwei-Photonen-Mikroskop, das die folgenden minimalen Anforderungen verwendet werden erfüllt: Es hat mit (a) einem gepulsten Laser abstimmbar auf ~ 860 nm, (b) mindestens zwei simultan erfassten Fluoreszenzkanäle, (c ausgerüstet werden ) Die Filter für die eCFP und Citrin Fluoreszenz, (d)ein Licht-Stimulator (für mögliche Designs finden 24,26), und (e) Software, ermöglicht die Aufzeichnung zeitversetzt Bildsequenzen mit einer Bildrate ausreicht, um den Ca 2+ Signale lösen von Interesse. Starten des Zwei-Photonen-Abbildungssystem, wie vom Hersteller angegeben. Folgen Sie ausschließlich Laser-Sicherheitsrichtlinien der Anlage. Starten Sie den Laser und stimmen Sie es auf ~ 860 nm. Bringen Sie ein Stück von der Haltekammer zu der Aufzeichnungskammer und sofort zu starten Perfusion mit carboxygenated extrazellulären Lösung. Aufrechterhaltung einer Perfusion Flussrate von 2 ml / min und einer Temperatur von 37 ° C in der Aufnahmekammer. Verwenden Sie eine 20-fach 0,95 NA Wasserimmersionsobjektiv. Falls verfügbar, verwenden Sie eine CCD-Kamera in Kombination mit einem Infrarot-LED unter Aufnahme Kammer, um die Netzhaut-Scheibe (Abbildung 2) zu lokalisieren. Ansonsten lokalisieren Scheibe mit Zwei-Photonen-Imaging (siehe 3.1.5). Wechseln Sie in den Zwei-Photonen-Imaging zu Biosensor Ausdruck anzuzeigen. Einschaltendie beiden Detektionskanäle für Fluoreszenz-Imaging von eCFP und Citrin. Verwenden Sie die Bildaufnahme-Software, die die Zwei-Photonen-Mikroskop zu scannen und wählen Sie eine Reihe von Kegelanschlüsse für die Aufzeichnung (3A) steuert. Set Bildaufnahme bis 128 x 16 Pixel-Bilder (31,25 Hz) oder eine ähnliche Konfiguration. Beschränken Sie gescannte Bereich um Kegel Terminals Bleichen von Photopigmente in äußeren Segmente zu vermeiden. Hinweis: Für die TN-XL Kalziumsensor (τ = ~ 0,6 sec für Ca 2+ bindenden, τ = ~ 0,2 sec für Ca 2+ freibleibend, siehe 16) Mindestbildrate von ca. 8 Hz wird empfohlen. Licht Stimulation und Ableitung Verwenden Sie eine Unterstufe Vollfeld-Licht Stimulator, wie anderswo beschrieben 10,21,26, um die folgenden Schritte durchführen. Hinweis: Eine einfache Lösung für eine Vollfeld-Licht Stimulator ist es, zwei bandpassgefilterten LEDs (zB "blue": 360 BP 12, "grüne": 578 BP 10) verwenden,daß der Wellenlängenempfindlichkeiten Maus Zapfen passen, aber gleichzeitig nicht mit den für die Fluoreszenzdetektion verwendeten Filter überlappen (vgl. 3.2.4). Das Licht von den LEDs wird von dem Kondensator durch den Boden der Aufnahmekammer (2) konzentriert. Weitere Informationen zu dieser Stimulator Design, seine Kalibrierung verwendet die Lichtintensitäten und die evozierten Kegel Foto-Isomerisierung Raten siehe 10,21,26. Schalten Sie den Laser und ermöglichen Kegel, um zum Scan-Laser und dem Reiz Hintergrundbeleuchtung anzupassen (20 – 30 sec, siehe auch mögliche Fallstricke) vor der Vorlage Lichtreize (siehe 3.2.3) oder die Anwendung pharmakologischer Wirkstoffe. Beginnen Darstellung willkürliche Reize (zB Lichtblitze, wie in 3B, C gezeigt). Im Fall des in Schritt 3.2.1 beschrieben Stimulator, erzeugen die Reize durch Modulation der Intensität der beiden LEDs im Laufe der Zeit mit einer Mikroprozessorplatine durch kundenspezifische Software-gesteuert (fürEinzelheiten finden 10,21,26). Aufzeichnen der zwei Fluoreszenzkanäle (beispielsweise bei 483 nm für die "blue" FRET-Donor eCFP und bei 535 nm für "gelb" FRET-Akzeptor, z. Daten siehe Tabelle 1) gleichzeitig mit dem jeweiligen Bildaufnahme-Software (siehe auch 3.1 0,6). Zum Beispiel im Fall von Lichtblitzen (3B, C), Rekord mindestens 8 – 10 Stimulus-Präsentationen (Studien). "In-slice" Ca 2+ Kalibrierung Nehmen Ca 2+ Signale in Kegel-Terminals (wie in 3.1.6 und 3.2.4) und extrahieren Sie die Baseline-Ca 2+ Ebene in einer Reihe von Kegeln (wie in 3.4 beschrieben). Auf "Ca 2+ frei" extrazelluläre Medium mit 5 & mgr; M Ionomycin (gelöst in DMSO) und 10 mM EGTA Schalter (oder alternativ BAPTA) zugegeben. Record Konus Klemmen wieder alle 5 min zu bestimmen, die minimale Fluoreszenzverhältnisses (R min), <em> dh das Verhältnis in der (in der Nähe) Fehlen von intrazellulären Ca 2+. 30 Minuten – das kann irgendwo zwischen 15 nehmen. Hinweis: Ein Perfusionssystem benötigt, das Umschalten zwischen verschiedenen Reservoirs ermöglicht. Schalter auf extrazelluläre Medium mit 5 uM Ionomycin (gelöst in DMSO) und 2,5 mM Ca 2+. Nach einer Inkubationszeit von 5 min, Aufzeichnung Kegel wieder alle 5 min, die maximale Fluoreszenzverhältnis (R max), dh das Verhältnis in der Gegenwart von sättigenden Konzentrationen von intrazellulärem Ca 2+ messen. 15 Minuten für die Ca 2+ Quote stabil zu werden – nach Ionomycin Anwendung kann es zwischen 3 zu nehmen. Hinweis: Das Aussetzen der Scheiben eine hohe Ca 2+ und Ionomycin für einen längeren Zeitraum wird schließlich die Zellen schädigen. Fügen Sie nur Zellen in der Analyse, die ihre normale Morphologie beibehalten. Konzentrationen (dh EGTA, Ionomycin) muss möglicherweise angepasst werden. Für weitere Einzelheiten über den Ca 2+ KalibrierungProtokoll finden 13,17. Datenanalyse Hinweis: Verwenden Sie eine Bildverarbeitung und Datenanalyse-Software-Paket mit dem jeweiligen Mikroskop-Software kompatibel und in der Lage läuft benutzerdefinierte Analyse Skripte. Laden Sie eine Bilddaten-Datei und ziehen Regionen von Interesse (ROIs) um jede Kegelanschluss (3A). Für jeden Rahmen, mittlere Fluoreszenzintensität innerhalb des ROI und Subtrahieren der Hintergrundfluoreszenz, vor der Berechnung des Verhältnisses (R) zwischen FRET-Akzeptor (Citrine) und Geber (eCFP) Fluoreszenz (R = F A / F D; 3B, C). Dieses Verhältnis ist in der Regel als Proxy für die relative intrazelluläre Ca2 + -Konzentration verwendet, aber nach der Kalibrierung (siehe 3.3), auch absolute Konzentration abgeschätzt werden (siehe 3.4.3). Anmerkung: Die Stiele können durch ihre Position in dem äußeren Plexiformschicht erkannt und ihre Morphologie (etwas abgeflacht "Blobs" kleiner als der Kegelsomata am Ende des Konus Neurit). Durchschnittliche Stimulus Studien (4A). Extrahieren Antwortparameter aus den gemittelten Spuren (4B), wie Ca 2+ Basisniveau (R Basis) vor Lichtstimulation, Spitze-Amplitude (R amp), und die Fläche unter der Kurve (R A) als Maß für die Antwortgröße. Auch extrahieren Reaktion Kinetik von gemittelten Spuren, wie Antwortanstieg (t Anstieg) und Abklingzeit (t Zerfall) (= jeweiligen Zeitintervalle zwischen 20% und 80% der R amp; siehe Abbildung in 4B). Für weitere Informationen, wie man diese Parameter zu bestimmen, siehe 10. Berechnen einer Schätzung der absoluten Kegel Ca 2+ Konzentration auf Basis der Messungen von Schritt 3.3.1-3.3.3. Mithilfe der Verhältnisse für minimale und maximale Ca 2+ -Konzentration, R min und R max jeweils die Donor-Fluoreszenz in der Ca 2+ </sup> -gebundenen (F D, Ca-gebundene) und -unbound (F D, Ca-freien) Zustand, wie auch die in-vivo-Dissoziationskonstante (K d = 0,77, siehe 16) für TN-XL mit der folgenden Gleichung (analog zu 27):

Representative Results

Durch die Kombination von vertikalen Scheiben aus HR2.1 hergestellt (Abbildung 1): TN-XL-Maus Netzhaut mit Zwei-Photonen-Imaging (Abbildung 2), konnten wir die ratiometrische Messungen der Lichtreiz hervorgerufene Ca 2+ Signale in Kegel Photorezeptor Axonterminalen führen . Dieser Ansatz stellt eine signifikante Verbesserung beim Zugriff und Visualisierung Maus Kegel über den bereits vorhandenen Verfahren der optischen Bildgebung mit synthetischem Ca 2+ Indikatoren. Zum Beispiel kann die kegelspezifische Expression des genetisch codierte ratiometrisch Ca 2+ Biosensor TN-XL erleichterte die Identifizierung der Konus Axonterminalen (siehe ROIs in 3A). Daher eliminiert unser Protokoll das Risiko von Aufzeichnungssignalen unklarer Genese, wie zum Beispiel "gemischte" Signale mit Beiträgen von beiden Zapfen und Stäbchen Axonterminalen. Unser Ansatz ermöglicht die Lösung Single-Studie Antworten auf der Ebene der indiviDoppelkegel Axon-Terminal. Licht-evozierte Extrusion von Ca 2+ aus dem Konus Endgerät wird durch eine Zunahme und eine Abnahme der Donor und Akzeptor-Fluoreszenz jeweils (3B) markiert. Abnahme des Fluoreszenzverhältnisses (R) entspricht, um die Extrusion von Ca 2+ aus dem Konus Anschluß (3C), durch das Licht induzierten Hyperpolarisation der Membran und anschließende Schließung der spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen verursacht. Da mehrere Kegel Axonterminalen können gleichzeitig überwacht werden (3A), ist die Datenerfassung sehr effizient und Hunderte von Kegel Ca 2+ Reaktionen können in einem einzigen Experiment gesammelt werden. Durch die Bewertung dieser Antworten quantitativ (Abbildung 4), können kegel Ca 2+ Signale verglichen und in einer Reihe von Bedingungen (siehe Diskussion) ausgewertet werden. Es ist oft ausreichend, um das Verhältnis zwischen FRET-Akzeptor (Citrin) und -donor (eCFP) Fluoreszenz verwenden(F / K-D; für Details siehe 3.4) als relatives Maß der intrazellulären Ca 2+ Ebene. Doch wenn nötig, das Verhältnis kann so kalibriert werden, um absolute intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen ([Ca 2+]) (5) zu erhalten. An der Hintergrundbeleuchtung in diesem Protokoll verwendet (Details siehe 10 und Abbildung 3 Legende), lieferte die Kalibrierung eine Schätzung für die absolute Ruhe [Ca 2+] in "Wildtyp" HR2.1: TN-XL Maus Kegelanschlüsse des 243 ± 159 nM (Mittelwert ± SD), die innerhalb des Bereichs für Mäuse in der Literatur berichtet wird, ist 11. Abbildung 1. Herstellung der vertikalen Netzhaut Scheiben. (A) isoliert und abgeflacht Netzhaut zum Schneiden vorbereitet. (B) Rechteckige Stück Netzhaut (see roten Feld in A) auf Filterpapier-Membran (dunkelgrau) nach dem Schneiden angebracht ist. (C) Draufsicht der Membran angebrachte Netzhautscheibe auf einem Deckglas mit Fett festgelegt. (D) Schematische Darstellung eines Teils einer Netzhaut-slice (siehe roter Kasten in C). Zapfen-Photorezeptoren sind in grüner Farbe angezeigt. V, ventral; D, Rücken; N, Nasen; T, zeitlich; OS, äußere Segment; ONL, äußere Körnerschicht; OPL, äußeren plexiformen Schicht; INL, inneren Körnerschicht; IPL, inneren plexiformen Schicht; GCL, Ganglienzellschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Zwei-Photonen-Imaging von Retinal Slices: Abbildung des Aufzeichnungskonfiguration Top:. Wasser-Immersions-Objektiv Fokussierung der seinUhr des Scanning-Laser (rot Pfeil nach unten) in die Netzhaut, und das Sammeln der emittierten Fluoreszenz (oben Pfeile). Die Linse sammelt auch tragene Infrarotlicht von einem unterhalb des Kondensators bei Abbildung der Scheibe unter Verwendung einer CCD-Kamera montiert Beleuchtung LED Center:.. Retinal Scheibe in der Aufnahmekammer, die mit extrazellulären Lösung montiert und perfundiert Unten: Kondensorlinse Fokussieren des Lichts von den LEDs Stimulations (und der Infrarot-LED für die CCD-Kamera-Imaging) durch den transparenten Boden des Aufnahmekammer in die Netzhautgewebe. IR LED, Infrarot-Licht-emittierende Dioden; CCD, Charge-Coupled Device; BP, Bandpass. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Licht Herbeirufungskostend Ca 2+ Antworten in Axonterminalen von Maus-Zapfen-Photorezeptoren. (A) links: Recordings konzentrierte sich auf synaptischen Terminals (rotes Feld) von Zapfen-Photorezeptoren (grün) in der Netzhaut Scheiben. Rechts: Beispiel für einen aufgezeichneten Bereich mit 7 einzelnen Anschlüsse. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung von zwei Kanälen aufgezeichnet. (; 535 BP 50 oben) und eine für den FRET-Donor eCFP (unten; 480 BP 32) eine für den FRET-Akzeptor Citrine (B) Licht hervorgerufenen Veränderungen in Citrine (F A) und eCFP (F D) Fluoreszenz in einem ROI erfasst. (C) Ca 2+ Antworten (als Verhältnis F / K-D) eines Kegels Terminal zu einer Serie von 1 sec helle Lichtblitze in 5 Sekunden Intervallen. ROI, Region of Interest; BP, Bandpassfilter; F, Fluoreszenzintensität; au, willkürlichen Einheiten; FRET, Förster-Resonanzenergietransfer; eCFP, verstärkt cyan fluoreszierendes Protein. Reizstärke (als poto-Isomerisierungsrate in 10 3 · P · s -1 pro Kegel):. 13,0 und 12,8 für die M- und S-Opsine bzw. das Hinzufügen auf eine Hintergrundebene (= LEDs aus, Anregung Laser-Scanning) von ~ 10 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4. Beispielhafte quantitative Analyse von Licht-evozierte Kegel Ca 2+ Reaktionen (A) Licht-evozierte Ca 2+ Antworten (als & Delta; R) von einer einzigen Kegelanschluss (Einzelversuche: grau Spuren, n = 16; Mittelwert:. Schwarze Kurve ) (B) Parameter für die mittlere Ca 2+ Reaktion bestimmt:. Ruhen Ca 2+ Ebene (R Basis), die die Grundlinie vor der Lichtstimulation, Antwort Größe wie area-under-the-Kurve (R A) und die Spitzenamplitude (R amp), die Kinetik der Reaktion Beginn (t Anstiegszeitintervall von 20% bis 80% der R amp) und Offset (t Zerfall Zeitintervall von 80% zu 20% der R amp). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5. Die Schätzung absolute Ca 2+ -Konzentration. Schonung Ca 2+ -Konzentration ([Ca 2+], als das Verhältnis F / K D) in 8 Kegel Axonterminalen in einer TN-XL Maus aufgezeichnet (Kreise, mit Mittelwert ± SD) für verschiedene extrazelluläre Lösungen: zweimal in Standardextrazellulären Medium (Ctrl 1 und 2), dann mit minimal ("Null") [Ca 2+] (10 mM EGTA) eind mit hoher [Ca 2+] (2,5 mm), wobei die beiden letztgenannten Bedingungen in Gegenwart von 5 uM Ionomycin zu extra- und intrazellulären Ca 2+ ausgleichen lassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Bereits bestehende Protokolle mit elektrophysiologische Einzelzellableitungen oder Ca 2+ Bildgebung mit synthetischen Fluoreszenzindikatoren kämpfen, um die Ca 2+ Dynamik in der Maus Zapfen-Photorezeptoren für eine Reihe von technischen Gründen (siehe Einleitung) aufzeichnen. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Messung der Ca 2+ Signale und sogar absolute Ca 2+ -Spiegel in einzelne identifizierte Maus Konus Klemmen in einer effizienten und relativ einfache Art und Weise.

Dieses Protokoll wurde bereits erfolgreich in drei Studien zu verschiedenen Aspekten der Kegel-Funktion bei gesunden Maus Netzhaut. In der ersten Studie 10 die HR2.1: wurde TN-XL Maus mittels Immunhistochemie, ERG Aufnahmen Zweiphotonen Ca 2+ Bildgebung und Pharmakologie ist, die zeigt, dass der Konus-spezifische Expression des Ca 2+ Biosensor nicht behindert Kegel Anatomie und Funktion. In der zweiten Studie 21, chromatischeund unbunten Antworteigenschaften der Maus Kegel wurden in der Netzhaut abgebildet und zeigt markante Unterschiede in der Konusfunktion zwischen dem "grünen" Opsin dominierten dorsalen und der "blauen" Opsin dominierten ventralen Maus Netzhaut. Diese regionalen Unterschiede in der Kegel-Eigenschaften abgestimmt die Differentialkontrastverteilung in der natürlichen Umwelt (dh Himmel gegen Masse), was darauf hindeutet, dass die unterschiedlichen spektralen Arten von Maus Kegel sorgen für (fast) optimale Abtastung der achromatischen Kontrasten und damit können Sie ein Angebot evolutionären Vorteil. In der dritten Studie 22 die gegenseitige Rückmeldung, dass Konus Axonterminalen erhalten von Horizontalzellen untersucht. Da alle vorgeschlagenen horizontalen Zellrückkopplungsmechanismen wirken auf spannungsabhängigen Ca 2+ Kanäle in den Kegel Axonterminalen 28 kann kegel Terminal Ca 2+ als Proxy für horizontale Zelle-zu-Kegel-Wechselwirkungen dienen. Die Studie von Kemmler und Mitarbeiter 22 Stützendie Ansicht, dass horizontale Zellen verwenden eine komplexe Rückkopplungssystem mit mehreren Mechanismen zur Photorezeptor Glutamat-Freisetzung zu steuern.

Diese Untersuchungen veranschaulichen die Vielseitigkeit der beschriebenen Protokolls und zeigen, dass es auf eine Vielzahl von Fragen Kegelfunktion und deren synaptische Kreise angepasst werden. Darüber hinaus ermöglicht das Protokoll studieren lokalen Ca 2+ Signalisierung in den verschiedenen Kegel Fächer, zu einem besseren Verständnis der Kegel Physiologie. Dieses Wissen ist wichtig, pathophysiologische Prozesse in degenerierenden Kegel zu verstehen, um schließlich ermöglichen die rationelle Entwicklung der potenzielle therapeutische Ansätze, insbesondere für degenerative Krankheiten, die Zapfen.

Im HR2.1: TN-XL Mauslinie wird der Ca 2+ Biosensor ganzen Kegel zum Ausdruck gebracht, mit Ausnahme des äußeren Segments. Dies bietet die Möglichkeit für die direkte und ratiometrische Beurteilung von Ca 2+ dynamischens in unterschiedlichen Konus Fächern. Da Änderungen in Ca 2+ -Strömen in dem äußeren Segment in Terminals über das Membranpotential und die resultierende Aktivierung von spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen reflektiert wird, können die Prozesse in dem äußeren Segment indirekt beobachtet werden.

Potenzielle Fallstricke:

Die Präparation der Retina ist ein kritischer Schritt: In der Maus, trennt sich die Netzhaut von der Augenmuschel in der Regel zwischen Photorezeptor und äußeren Segmente Pigmentepithel. Daher werden die lichtempfindlichen Photorezeptor äußeren Segmenten der isolierten Retina ausgesetzt und sehr empfindlich gegen mechanische Beschädigungen. Es ist sorgfältig darauf nicht durch Berühren des Fotorezeptorseite mit Werkzeugen oder durch Bewegen der Gewebe seitlich auf einer Klebefläche (zum Beispiel eine Filtermembran) nicht beschädigt werden.

Hochwertige Netzhautscheiben können unter dem Mikroskop durch ihre saubere Schnittoberfläche erkannt unddurch eine gut organisierte Photorezeptorschicht mit klar definierten Außensegmente. Funktionelle Beurteilung von Schichtqualität kann schnell durch blinkende helle Lichtreize und Bestimmung des Prozentsatzes reagiert Kegel (- 20 Kegeln zB in einem Sichtfeld mit 10) durchgeführt werden. Hier sollte Antwortqualität durch Berechnung des Signal-Rausch-Verhältnis (S / N) (Amplitude des Grundlinienrauschen vor der Lichtreiz vs. Amplitude der Lichtantwort) ermittelt werden; ein S / N von 2 bis 3 ist als der Mindestschwellenwert berücksichtigt werden. Typischerweise verwerfen wir Scheiben mit weniger als 50% reagiert, Kegel. Auch Scheiben mit Zapfen, die übermäßige spontane spiking Verhalten (siehe Abbildung 4 in 10) muss verworfen werden angezeigt.

Slices in der Aufnahme Kammer, die die oben genannten anatomischen und funktionellen Kriterien erfüllen zeigen konsistente Antworten für 1-2 h (für Details über Antwortkonsistenz siehe 10). Da Scheiben überleben huns in der Aufnahmekammer kann ein erfolgreiches Experiment bis zu 6 Stunden dauern. Es ist bemerkenswert, dass es einige Einschränkungen hinsichtlich des Studiums langreichende räumliche Interaktionen zwischen Kegel und Horizontalzellen, wie Slicing zwangsläufig durchtrennt seitlichen Anschlüssen in der Netzhaut-Netzwerke. Die Erhöhung der Dicke der Netzhaut Scheiben bis 300 um mildert dieses Problem 22.

Die Verwendung von vertikalen Retinascheiben vermeidet Abtastung der lichtempfindlichen Kegelaußensegmente von dem Anregungslaser und somit weitgehend verhindert Opsin Bleich (für ausgedehnte Diskussion siehe 10,21). Dennoch werden die aufgezeichneten Signale Ca 2+ nicht nur auf die Lichtreize abhängen, sondern auch von einer durch das Abtasten Anregungslaser erzeugte Hintergrundbeleuchtung Komponente beeinflusst zu werden. In der Tat ist die wirksame Hintergrundbeleuchtung in einer solchen Zwei-Photonen-Imaging Experimente eine Kombination von gestreutem Laserlicht, fluoreszierendes Licht, das von dem aufgezeichneten ce emittiertenlls, und jede LED Reiz Hintergrundkomponente. Daher sollte Zapfen erlaubt, um mindestens 20 anzupassen – 30 s mit Laserabtastung (mit der Hintergrundkomponente des Lichtreizes eingeschaltet) wird vor der Aufzeichnung.

Vorteile und Anwendungen:

Während einige Anwendungen für diese Kegel Ca 2+ -Imaging Protokoll oben 10,21,22 beschrieben worden ist, können andere Anwendungen denkbar: Pharmakologische Studien in Kombination mit Kegel Ca 2+ Bildgebung kann Ca 2+ validieren Signalwege in Kegel und könnte verwendet werden, um die Wirksamkeit und Potenz der Medikamente gegen verschiedene Spieler in Ca 2+ testen -signaling 10. Jedoch kann eine Schlüsselanwendung sein, um Krankheiten Kegel Funktion zu beeinträchtigen studieren. Viele Netzhautdegeneration Mausmodellen imitiert menschliche Krankheiten zur Verfügung stehen. Zum Beispiel ist der Kegel Photorezeptorverlust 1 (CPFL 1) Maus eine primäre Zapfen-Degeneration Modell Leidenaus einer Mutation Pde6c 29. Umgekehrt leidet die Stange Degeneration 1 (rd 1) Maus von einem PDE6B Mutation. Während dies bewirkt, dass primäre Photorezeptordegeneration Stange 30, einmal rd 1 Stange Verlust abgeschlossen ist, sekundären Zapfen-Degeneration Sätze in 1. Kreuzung, diese Tiere mit dem HR2.1: TN-XL Linie ermöglicht das Studium und den Vergleich Ca 2+ Dynamik sowohl in der primären und sekundären Zapfen-Degeneration und dürfte wertvolle Einblicke in die Rolle von Ca 2+ während Kegel Zelltod bereitzustellen. Auch pharmakologisch induzierte Zapfen-Degeneration – zum Beispiel unter Verwendung von selektiven Inhibitoren PDE6 – kann dazu dienen, die nachgeschalteten Mechanismen der Zapfen-Degeneration 10,29,31 identifizieren.

Zusammenfassend beschrieben das Protokoll hier ermöglicht die Messung Ca 2+ in subzellulären Kompartimenten der Maus Zapfen-Photorezeptoren und eröffnet große Chancen, um Kegel Physiologie in einem weiten Bereich aufzudeckenvon physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für das Screening von pharmakologischen Wirkstoffen entwickelt, um mit Kegel Ca 2+ -signaling stören und somit helfen, neue Therapien für Krankheiten zu etablieren Kegel verwendet werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

Materials

High vacuum grease Dow Corning 1018817 http://www.dowcorning.com
Cover slips R. Langenbrinck 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Glass slides R. Langenbrinck 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Blades for tissue chopper MARTOR KG ARGENTAX No. 1044 0.25 mm; http://www.martor.de
Tissue chopper Custom-build Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert
Nitrocellulose filter membrane gridded Merck Millipore AABG01300 Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP CP pharma AP/DRUGS/220/96 http://www.cp-pharma.de
UV/green LED-based full-field stimulator Custom-build for details, see10
Open source microprocessor board Arduino http://www.arduino.cc
Imaging software CfNT Custom-written developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany
IgorPro Wavemetrics http://www.wavemetrics.com
VC3-4 System focal perfusion system ALA Scientific Instrument with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) Newport Spectra-Physics http://www.spectra-physics.com
Movable objective microscope (MOM),
Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany		 Sutter Instruments http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
XLUMPlanFL 20x/0.95w objective Olympus http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 series Surgivet http://www.surgivet.com
Ionomycin, Calcium salt Life technologies I24222 http://www.lifetechnologies.com
EGTA Sigma-Aldrich E3889 https://www.sigmaaldrich.com
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 101191250 http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95 leica microsystems http://www.leica-microsystems.com/
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Kulkarni, M., Schubert, T., Baden, T., Wissinger, B., Euler, T., Paquet-Durand, F. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), e52588, doi:10.3791/52588 (2015).
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