فسيفساء اسماك الزرد Transgenesis لتحليل الجينوم الوظيفي للجينات التعاونية المرشح لورم إمراض
Summary
The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.
Abstract
Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.
Introduction
السرطان هي أمراض التقدمية والتي تمثلت في تراكم الطفرات المرضية والحذف ومكاسب الكروموسوم مع مرور الوقت. ويمكن لهذه التشوهات الجينية تؤثر على العمليات الخلوية متعددة بدءا من دورة الخلية، موت الخلايا، والتمثيل الغذائي حيوية وتجميع الهيكل الخلوي للتأكيد الردود مثل نقص الأكسجة. وبالتالي، تكون الأورام يعكس الإجراءات الجماعية من الانحرافات الجينية المتعددة عبر مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد حددت الجهود الأخيرة التكاملية بحوث الجينوم، بما في ذلك كله تسلسل الجينوم، exome التسلسل، والتسلسل المستهدف، تسلسل عميق والدراسات رابطة الجينوم على نطاق، فإن عددا متزايدا من تغيرات جينية جديدة في الأساس جميع أنواع الأورام 1-4. في كثير من الحالات، تحدث الآفات الوراثية معا بطريقة غير عشوائية 5-8، مما يشير إلى تعاونهما في إمراض المرض. تشريح الأدوار أنكجنيك من مجموعة كبيرة من الجينات وأعرب aberrantly الناتجة وROM هذه الآفات الجينومية هو ضروري لوضع استراتيجيات علاجية جديدة وفهم استجابات الخلايا السرطانية لهذه العوامل، ولكن ثبت أن يكون مهمة شاقة، تتطلب أنظمة نموذج حيواني قوية للغاية لإجراء الإنتاجية العالية التحليل الجيني وظيفية في الجسم الحي.
وعلى الرغم من الثدييات، وخاصة القوارض، هي نماذج المفضلة في بيولوجيا السرطان، بدأت الزرد لجذب اهتماما كبيرا. وقد استخدم الزرد مكتملة العظام (داريو rerio) كما كائن نموذج لدراسة التنمية منذ 1960s و تم تطبيق أول لدراسة الورم المرضية في عام 1982 9-11. سهولة الصيانة، وحجم الجسم صغيرا، وخصوبة عالية تجعل من الزرد نموذج قوي للشاشات الوراثية إلى الأمام على نطاق واسع لتحديد الطفرات التي تمنح الظواهر الشاذة والمرضية 10. الشفافية البصرية من الأجنة الزرد هي سمة رئيسية أخرى دعم التوسع في استخدام هذا النموذج السرطان، كماأنه يسمح في مجال التصوير فيفو التي ستجرى لتحديد موقع الورم تنمية في الوقت الحقيقي 9، أحد التطبيقات التي يصعب نسبيا في القوارض 12. كشفت مؤخرا تحليل الجينوم النسبية للجينوم إشارة الزرد (Zv9) 26206 الجينات المكودة للبروتين، مع 71٪ ذات orthologues الإنسان، والتي ترتبط 82٪ مع الجينات المرتبطة بالمرض في الميراث المندلية اون لاين في مان (OMIM) قاعدة بيانات 13، 14. ونتيجة لذلك، تم استخدام الزرد لنموذج مختلف أنواع السرطانات البشرية، بما في ذلك العصبية 8، T-خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL) 15،16، 17،18 سرطان الجلد، ساركومة يوينغ 19، 20،21 العضلية المخططة، وسرطان البنكرياس 22، سرطان الكبد 23 و النخاعي الأورام الخبيثة 24،25، وقد تم اختيار كنموذج السرطان لزرع الأعضاء يدرس 11،26.
والمعدلة وراثيا مستقرةويستخدم النهج في الزرد عادة لدراسة تأثير مكسب من وظيفة الجينات في التطور الطبيعي أو المرضية المرض 27،28. لتطوير مثل هذا النموذج (الشكل 1A)، واحد يضخ بناء الحمض النووي الذي يحتوي على الجينات في المصالح يقودها المروج الأنسجة محددة في خلية واحدة من النوع البري الأجنة. بعد ثلاثة إلى أربعة أشهر الحقن، وعندما تصل الأجنة حقن النضج الجنسي، وoutcrossed أنهم مع من النوع البري الأسماك للكشف عن تلك التي تبين تكامل DNA بناء في سلالة الجرثومية، والتي ترخص لهم من الأسماك مؤسس. هناك العديد من العوامل، مثل عدد النسخ والموقع التكامل من التحوير، تؤثر تعبير عن التحوير في خطوط المعدلة وراثيا مستقرة. وهكذا، لتطوير نموذج الورم المعدلة وراثيا، متعددة خطوط المعدلة وراثيا مستقرة overexpressing على الجين الورمي واحد يجب أن تكون ولدت أولا وفرزهم للخط التعبير عن التحوير على المستوى قد يؤدي إلى ورم الاستقراء. ومع ذلك، إذا overexpression من وس المرشحncogene غير سامة للخلايا الجرثومية، فإنه من الصعب لتوليد خط المعدلة وراثيا مستقر من قبل overexpressing مباشرة التحوير 29. وبالتالي، يمكن أن يكون هذا النهج تستغرق وقتا طويلا، مع ارتفاع مخاطر الفشل في توليد نموذج سرطان مناسب.
هنا، نحن لتوضيح استراتيجية بديلة تقوم على transgenesis عابرة الفسيفساء (الشكل 1B) التي توفر مزايا فريدة على transgenesis مستقر التقليدي للدراسة الجينوم وظيفية في الجسم الحي. في هذا النهج، يتم حقن واحد أو أكثر من يبني التحوير في مرحلة خلية واحدة من المعدلة وراثيا أو من النوع البري الأجنة. يبني DNA حقن تحتوي على الجينات المحورة ثم يتم دمجها mosaically وبشكل عشوائي في الأسماك حقن الأولية، مما أدى إلى الأنماط الجينية مختلطة داخل السكان الخلية متعددة في الأسماك الفردية 30. وعلاوة على ذلك، coinjection من DNA متعددة يبني في الأجنة خلية واحدة يؤدي إلى التكامل المشترك في نفس الخلية في مواقع عشوائية، مما يسمح احد لهيئة تنظيم الاتصالاتCE الخلايا مع التعبير عن الجينات المحورة واستكشاف التفاعلات بين الجينات المختلفة خلال المرضية المرض في الحيوانات الفسيفساء 31. وكدليل على المبدأ، ونحن overexpressed عابر ALK تنشيط mutationally (F1174L) مع mCherry مراسل الجينات في الجهاز العصبي الودي المحيطي (PSNS) تحت سيطرة هيدروكسيلاز الدوبامين بيتا (د βh) المروج في البرية من نوع السمك والأسماك المعدلة وراثيا overexpressing MYCN. ALK، الذي يشفر مستقبلات التيروزين كيناز، هو الجين المتحور الأكثر تواترا في العصبية عالية المخاطر 5-7،32،33. ALK (F1174L)، باعتبارها واحدة من الطفرات الجسدية تفعيل الأكثر شيوعا وقوية، غير ممثلة تمثيلا زائدا في MYCN- تضخيم المرضى العصبية عالية المخاطر والتآزر مع MYCN overexpression لتسريع العصبية تكون الأورام في كل من الفئران المعدلة وراثيا مستقرة ونماذج الزرد المعدلة وراثيا 8،34،35. بواسطة فسيفساءoverexpression عابر ALK (F1174L) مع mCherry في الأسماك المعدلة وراثيا MYCN، ونحن لخص تسارع ظهور الورم لوحظ في الأسماك المعدلة وراثيا مستقرة overexpressing كلا ALK (F1174L) وMYCN، مما يشير إلى أن الاستراتيجية transgenesis الفسيفساء يمكن استخدامها لبسرعة وكفاءة تقييم المساهمات النسبية من الجينات المسرطنة متعددة في بدء الورم في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة التمثيلية، كنا coinjection عابرة وcoexpression من ALK تفعيلها مع مراسل الجينات mCherry في MYCN -expressing الأسماك المعدلة وراثيا لإظهار أن هذه الجينات تتعاون لتسريع ملحوظ بداية العصبية، بما يتفق مع النتائج السابقة لدينا في مجمع مستقرة coexpressing الأسماك المعدلة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex’s Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children’s Cancer Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 |
| pCR-TOPO vector | Invitrogen, CA | 451641 |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs, MA | M0202M |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix |
Invitrogen, CA | 11791-100 |
| Gateway® BP Clonase® II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 |
| GC-RICH PCR System | Roche Applied Science, IN | 12 140 306 001 |
| Meganuclease I-SceI | New England Biolabs, MA | R0694S |
| Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope | Nikon, NY | |
| Nikon digital sight DS-U1 camera | Nikon, NY |
References
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
- Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
- Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
- Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
- George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
- Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
- Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
- Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
- Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing’s sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
- Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).
- Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
- Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
- Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
- Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
- Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
- Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
