Adelante Genética pantallas usando macrófagos identificar<em> Toxoplasma gondii</empara la resistencia a IFN-γ por células dependiente> Genes Importante Inmunidad Autónoma

Toxoplasma gondii (T. gondii) es un intracelular obligado, protozoos patógenos. Es el agente causante de la toxoplasmosis, un peligro para la salud en individuos inmunocomprometidos. También es el sistema modelo para otros patógenos que infectan a los seres humanos apicomplexan incluyendo Cryptosporidium y Cyclospora. La toxoplasmosis se adquiere con mayor frecuencia a través de la ingestión de alimentos o agua contaminados con la etapa bradizoíto o ooquistes del parásito. Después de la ingestión, estas etapas se convierten en el escenario taquizoíto del parásito que se replica dentro de las células huésped y disemina sistémicamente. Células T, IFN-γ y, en menor medida, el óxido nítrico ^1-4, son importantes para el control de la infección, pero no son capaces de eliminar la enfermedad, como una proporción de taquizoítos se convierten en la etapa de bradyzoite que están protegidos dentro de quistes tisulares resultando en una infección crónica de larga duración. De hecho, no hay terapias eficaces contra el quiste s crónicataje de la enfermedad. Toxoplasmosis severa es más a menudo debido a la reactivación de la infección persistente, con la etapa bradizoíto del parásito convertir de nuevo a la fase de replicación rápida característica taquizoíto de la infección primaria y aguda.

La supervivencia temprana en la cara de la respuesta inmune innata es importante para permitir que el parásito para alcanzar el número de parásitos suficientes, así como para llegar a sitios distales, para permitir el establecimiento de la infección crónica. T. gondii ha desarrollado estrategias para contrarrestar los mecanismos de defensa del huésped que probablemente contribuyen a su capacidad de replicar y difundir principios de la infección. En primer lugar, T. gondii forma un PV única durante la invasión parásito que es en gran parte segregados de los procesos de endocitosis y exocytic de la célula huésped en comparación con otros patógenos intracelulares ^5-9. Además, como todos exitosa T. patógenos intracelulares gondii modifica su célula huésped para crear un ambiente permisivo fo el crecimiento. Esto incluye anfitrión reprogramación de la expresión génica de células mediante la alteración de los factores de transcripción de la célula huésped, incluyendo aquellos que son importantes para la regulación de la activación de células ^10-15. ROP16 ^16-19, GRA15 ^{20, 21} y GRA16 GRA24 ^22, han demostrado ser importantes en la regulación de la respuesta transcripcional y señalización celular cascadas de células huésped infectadas con T. gondii. Estudios recientes utilizando cruces genéticos entre las cepas del parásito con fenotipos distintos han sido muy productivo en la identificación de genes del parásito que subyacen rasgos genotipo dependiente de parásitos incluyendo evasión de la inmunidad relacionada GTPasas (IRGs) ^16,19,23-26. En ratones, GTPasas de inmunidad relacionada (IRGs) son críticos para el control de tipo II y III genotipos del parásito mientras que el tipo muy virulenta I genotipos han desarrollado mecanismos para evadir las IRGs murinos. Sin embargo, también es claro que el parásito ha desarrollado mecanismos para evadir medios antimicrobianoTdR en Además de los IRGs y que algunos de estos mecanismos pueden ser conservadas a través de los genotipos de parásitos ^27,28. Además, se sabe muy poco acerca de los mediadores críticos de la inmunidad celular autónoma contra T. gondii toxoplasmosis durante humano. Genes de parásitos importantes para la resistencia a los mediadores de la inmunidad celular autónoma también pueden ser importantes para la supervivencia durante taquizoíto a bradizoíto conversión que también puede ser provocada por respuestas inmunitarias del huésped. Por ejemplo, el óxido nítrico a niveles altos puede suprimir la replicación del parásito en los macrófagos infectados pero también puede estimular a bradyzoite de taquizoitos de conversión resultante en la producción de quiste ^30-32.

ToxoDB es una base de datos genómica funcional para T. gondii que funciona como un recurso crítico para el campo en términos de proporcionar información de la secuencia para el genoma del parásito y el acceso a los datos publicados y no publicados escala genómica incluyendo anotaciones de la comunidad, exp gen resión y proteómica de datos ^33. Similar a muchos patógenos protozoarios, la mayoría del genoma consiste en genes hipotéticos con información no disponible sobre la base de homología genética para dar una idea de sus funciones potenciales. Por lo tanto, la genética hacia adelante es una poderosa herramienta para identificar nuevos genes de parásitos importantes para la evasión inmune, la conversión quiste y otras funciones críticas para la patogénesis del parásito, así como para la conversión entre las etapas de desarrollo distintas. Una fuerza adicional de la genética hacia adelante es que puede ser utilizado como un enfoque relativamente no sesgada para interrogar el parásito en cuanto a los genes que son importantes para tareas específicas en la patogénesis, incluyendo la evasión inmune y la formación de quistes. Los últimos avances en la secuenciación de próxima generación para el perfil mutacional han convertido en un método de elección para la identificación de los genes del parásito responsable de los estudios de genética hacia adelante usando mutagénesis química y de inserción ^34-37.

ntent "> Es importante identificar las vulnerabilidades de T. gondii que pueden ser explotados para mejorar la eficacia de los mecanismos inmunes celulares autónomas contra el parásito en particular los que también pueden ser activos frente a la etapa de quiste resistente. Con este objetivo, un in vitro murino infección de los macrófagos y modelo de activación fue desarrollado para identificar las mutaciones en el parásito que perjudica específicamente T. gondii gimnasio después de la activación de los macrófagos infectados, pero no en los macrófagos ingenuos. Se utilizó Esta pantalla macrófagos para interrogar a una biblioteca de T. gondii mutantes de inserción con el fin de, en última instancia identificar los genes de T. gondii importantes para la resistencia al óxido nítrico ^27,28. El aislamiento de un panel de mutantes de T. gondii con una alteración de la resistencia a la activación de macrófagos infectados, en particular una marcada sensibilidad a la óxido nítrico, ha demostrado la utilidad de la pantalla para identificar genes de parásitos importantes para la resistenciaa los mediadores de la inmunidad celular autónoma distinta de los mecanismos de resistencia descritas para los IRGs murinos ^28. Mutagénesis de inserción tiene ventajas sobre mutagénesis química en términos de generar un número limitado de mutaciones aleatorias en cada clon parásito y, en teoría, más fácil identificación del sitio de la mutación. Sin embargo, identificar el sitio genómico de la inserción del plásmido en T. mutantes de inserción gondii, en la práctica, ha sido sorprendentemente difícil en muchos casos ^37. La inserción de un plásmido en un gen también es probable que interrumpir la función de un gen en contraste a mutagénesis química que típicamente resulta en cambios de nucleótidos individuales. Sin embargo, mutagénesis química, ya sea con-N-nitrosourea N-etil (ENU) o sulfonato de etilmetano (EMS) puede ofrecer una mayor capacidad para analizar una porción más grande del genoma del parásito, en comparación con la mutagénesis de inserción, ya que crea múltiples polimorfismos de nucleótido único ( estimado en 10 -100) por ³⁴ mutante, De 38 años. Por otra parte, los recientes avances en toda genoma de perfiles ha hecho posible el uso de la secuenciación de próxima generación para identificar los genes candidato más probable responsable del fenotipo identificado de un parásito mutado ^34,38. Independientemente del enfoque de mutagénesis, la confirmación de la función del gen parásito en la resistencia a la activación de los macrófagos en última instancia requiere eliminación y complementación génica para cumplir los postulados de Koch molecular.

La capacidad para diseccionar la función de un gen mediante la manipulación genética de tanto el parásito y el macrófago es importante ya que muchos de los genes identificados a través de la genética hacia adelante en T. gondii, así como otros patógenos, todavía se caracterizan como genes hipotéticos con poca o ninguna homología de secuencia con otras proteínas con funciones conocidas. El presente documento describe un enfoque general que se puede utilizar para identificar si el gen alterado en un mutante es importante para la resistencia a un conocido odesconocido mediador de la inmunidad celular autónoma. El análisis inicial de los factores antimicrobianos de acogida se realiza mediante la evaluación de la supervivencia de tipo salvaje y parásitos mutantes en los macrófagos de ratones de tipo salvaje frente a aquellos con deleciones de genes específicos en óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), gp-91 phox (NADPH oxidasa), y inmunidad relacionada GTPasas específicos (IRGs). Esto determinará si los genes del parásito identificados son importantes para la resistencia al óxido nítrico, intermediarios reactivos del oxígeno o relativas a la seguridad GTPasas ^28, respectivamente, o si un mecanismo inmunológico desconocido se tratara. La activación de los macrófagos infectados tanto con IFN-γ y LPS, descritos en el protocolo actual, resulta principalmente en el aislamiento de genes de parásitos importantes para la resistencia al óxido nítrico ^28. El uso de agentes farmacológicos que inducen la óxido nítrico en la ausencia de la activación de macrófagos (donantes de óxido nítrico) confirmó que la mayoría de los genes identificados eran importantes para reresistencia al óxido nítrico en lugar de óxido nítrico en concierto con mediadores adicionales asociados con la activación de los macrófagos ^28.

Paso uno y dos describen una pantalla genética adelante diseñada para aislar mutantes parásito con un defecto físico después de la activación de los macrófagos derivados de médula ósea infectadas in vitro. Paso uno describe un análisis de ajuste de la dosis para determinar empíricamente una dosis de γ y LPS IFN utilizar para la activación de los macrófagos, que reduce la replicación del parásito pero no inhibe completamente la replicación de tipo salvaje T. cepa parental gondii que se utiliza para la creación de la biblioteca de mutantes de parásitos. Paso dos describe la pantalla hacia delante genética de los clones mutantes en los macrófagos en placas de 96 pocillos. Paso tres describe un enfoque para confirmar el fenotipo de cada mutante identificado en la pantalla de las placas de 96 pocillos y para evaluar si el defecto en cada mutante afecta a la supervivencia del parásito, la replicación,o la producción quiste en respuesta a la activación de macrófagos. Paso cuatro describe el uso de macrófagos derivados de médula ósea de ratones con deleciones en las vías de antimicrobianos específicos para identificar los mediadores inmunes a la que el mutante parásito es específicamente susceptible. Paso cinco describe un enfoque para determinar si un mutante parásito también se ve comprometida para la patogénesis in vivo según se evaluó por la producción de quistes en los cerebros de los ratones infectados.