比色金ナノ粒子アッセイに適用される構造スイッチングアプタマーを選択するための方法

1.図書館とプライマー設計と合成 25,26（このトピックでは、以前の出版物で広く検討されている）最初のライブラリおよびプライマーを設計します。 標準的なホスホルアミダイト化学を使用して、この研究のために、以下の配列を合成する。 ライブラリ：GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA フォワードプライマー：GGAATGGATCCACATCCATGG リバースプライマー：ビオチンAAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA ライブラリーの5 '領域に相補的であるようにするcDNA捕捉プローブを設計する。増加した融解温度を供給する後続の各塩基と、わずかにRT上記融解温度を提供するためにオンライン溶融温度ソフトウェアの分析による初期長さを選択してください。 マー捕捉プローブ：CCATTCCビオチンマー捕捉プローブ：TCCATTCCビオチンマー捕捉プローブ：ATCCATTCCビオチン標準HPLCによるライブラリを精製する。脱塩は基本仕様であるプライマーと捕捉プローブのためのcient。数ヶ月まで-20℃で所望の濃度と店舗でのヌクレアーゼを含まない水でオリゴヌクレオチドを​​再構成する。 2.バッファ、図書館、サンプル調製ミリポアまたは50 mMトリス、137のNaCl、5mMのMgCl 2、pHが7.4の濃度のヌクレアーゼフリーグレードの水でバッファの500ミリリットルを準備します。無菌0.2μmの膜を通してバッファをフィルタリング。ストレージヶ月間、周囲条件で可能である。 あるいは、 等 PBS（リン酸緩衝生理食塩水）、HEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）などの他のバッファーを使用 2サーモを設定する。 95℃に1を設定し、周囲条件（この作品で〜20℃）で他を保つ。アイスバケットを準備します。 熱/サーモセットA（10 15 -10 16配列について〜2.5ナノモル）100μlのライブラリを配置することによって、DNAライブラリーを冷却スナップ5分間トン95°C。磁気ビーズを準備している間（セクション3.1から3.6）チューブを氷上に置きます。 λ= 260nmでのUV吸収によるDNAライブラリーの実際の濃度を決定し、ライブラリの適切な変換係数を適用する。 ターゲット·溶解性のための媒体の適切な中で、目標のストック溶液を準備します。 DMSO中100mMの分析物のストックを準備します。これらの株式は、周囲条件で保存され、約1カ月生存しているが、別のターゲットは異なる分解プロフィールのデモンストレーションを行います。 磁気ビーズと選択の初期ラウンドの調製ボルテックス6.7×10 8ビーズ/ mlのストレプトアビジン被覆磁気ビーズと新しいマイクロチューブに400μlのを削除します。 2分間磁石上にチューブを置き、上清を除去。 、結合緩衝液の400μlのを追加し、ボルテックスし、配置した後、上清を吸引することにより、ビーズを洗浄ビーズを分離するための磁石にチューブ。このプロセスを3回繰り返します。 50μM（最終）捕獲プローブと400μlの結合緩衝液中でビーズを再懸濁し、周囲条件でサーモミキサー上で穏やかに攪拌しながら10分間インキュベートすることによって、磁気ビーズ上の捕捉プローブを固定化する。 無料の捕捉プローブを除去するためのセクション3.2で説明した洗浄ステップを繰り返すことによって、結合緩衝液の400μlのビーズを3回洗浄します。 結合緩衝液400μlのビーズを再懸濁します。次のステップのためのビーズ溶液100μlを外し、3週間の最大のためのさらなる選択ラウンドに使用する4℃で、残りの300μlのを保持します。 3.2節で説明したように、結合緩衝液200μlで二回ビーズを洗ってください。 スナップ100μlの洗浄したビーズにセクション2.3からDNAを冷却して追加し、周囲条件でサーモミキサーを使用して穏やかに撹拌しながら30分間インキュベートする。 NOTE：最初のラウンドでのDNA濃度は、特有の配列は、理論的に存在している以前のラウンドでの配列の損失を最小限にするその後のラウンドのものよりも高い。 2.3節のように、UV吸収を用いて上清中のDNAを定量し、ビーズに結合したDNAの量を評価するためにセクション3.7で追加された初期量からこれを差し引く。 周囲条件で5分間、サーモミキサーで穏やかに撹拌しながら、結合緩衝液200μlの二つの追加回洗浄し、結合緩衝液200μlでビーズを洗ってください。 結合緩衝液で希釈した100μMの標的200μlのビーズを再懸濁し、そして周囲条件で30分間、サーモミキサー上で回転する。ターゲットと制御が時間をかけて、水溶液から集約することが観察されたため、以前の選択に、毎日の初めに新鮮なワーキング溶液を調製する。ターゲット溶出配列を含む上澄み液を保持さらなる研究のための。 セクション3.8.1で作成ビーズに1μMのプロゲステロンの200μlのを追加して1-2ラウンド終了後の負の選択を行います。周囲条件でサーモミキサー上で30分間穏やかに振とうする。 ビーズを捕捉し、前のセクション3.9のように、コルチゾールのほかに結合バッファー200μlの二回ビーズを洗浄、上清を廃棄するように磁気スタンドを使用してください。 4.濃縮モニタリング、PCR、および一本鎖DNAの生成選択濃縮を監視するために透析カセットに上澄み液を加える。透析は、コルチゾールが存在するため、DNAよりもはるかに高い濃度で溶出したDNAからコルチゾールを除去することが必要であり、また、標準的なDNA UVλ 最大 = 260nmのと重なるUV吸収ピークを有する。 このステップを選択の初期のラウンド内の他のすべてのラウンド（ラウンド2、4、6、および8）を実行します。これは、サンプルロスを軽減sの各シーケンスの潜在少ないコピー数（最高多様性）が存在するとき。より速く結果を得るために、そのようなサイズ排除カラムのような別の方法も利用することができる。 二回、周囲条件で2時間の結合緩衝液新鮮250mlのサンプルを有するカセットを透析する。バッファーを交換し、4℃CO / Nでインキュベートする。 （セクション3.8の結果と比較して）ターゲットによって溶出したDNAの割合を決定するために、UV分光法によって透析プールを分析します。 エチジウムブロマイドw ​​/ vの1％と3％アガロースゲルを準備します。この作品では、アガロースの1.5グラム、TAE緩衝液（40 mMトリス酢酸、1mMのEDTA、pHは= 8.0）の50ミリリットル、エチジウムブロマイド10μlのからゲルを調製。 〜5-15サイクルを使用して小規模PCR（5×50μlのアリコート）を行うことによって透析したプールをサイクル·最適化する。 PCR構成要素については、1×PCR反応緩衝液（全て最終濃度）、200μMのdNTP、DNAテンプレートの10％の反応容積、500 nMの各プライマー、および2.5を使用してUポリメラーゼ（2.5 U /μLストック）。 2分間95℃で最適化された条件を用いてPCRを実行し、その後、72℃（10〜95℃（30秒）、55℃（30秒）、72℃（1分）の反復サイクル、続いて分）、最終伸長し、4℃で保持する。 比較のために25bpの標準ラダーを採用し、ゲルイメージャーで可視化する。不要な副産物ずに正しいサイズマーカーで最高強度のバンドを生産サイクルの数を選択します。 6Xブルー/オレンジローディング色素の2μlの各PCRサイクルの10μlのを組み合わせて、ステップ4.4（45分間125 V）で調製し、3％アガロースゲルの5つの別々のウェルにロードすることによって、サイクルの最適化の結果を分析します。 セクション4.5で決定された条件と適切なサイクル数を利用し、大規模なPCRを行います。通常のPCR反応6-8 mLのこの選択で各ラウンドのために使用される1〜2.5ナノモルを得るために必要であった。簡素化するために、8ストリップチューブを使用して、PCR増幅のためにこのボリュームをアリコートするために必要な多くのチューブの取り扱い。 4.4節で説明したように、3％アガロースゲルを調製し、PCR産物のバンドはセクション4.5.2-4.5.3の手順に従って、正しい場所に表示されていることを検証する。 以下の手順により、一本鎖DNAにセクション4.7から全体の二本鎖DNA産物を変換します。 フリットによってブロック小塔にストレプトアビジン被覆ビーズ（磁気ではない）の300μlを添加する。ルアーロックシリンジを取り付け、プランジャに穏やかな圧力を加えることにより、結合緩衝液5mlでビーズを洗浄する。列から注射器を取り外し、ビーズが、プランジャ吸引によって妨害されないように、各材料の添加後にオフラインシリンジからプランジャーを取り外します。 PCR産物を追加し、プラ​​ンジャーで穏やかな圧力を使用してカラムに通し。 PCR産物を超えない1-1.2よりmlの各カラムに添加されるように複数の列を使用する。最終FLを破棄DNAは、アンチセンス鎖上のビオチン部分によってカラム上に保持されるので、スルーOW。 結合バッファー5ミリリットルでカラムを洗浄します。 0.2 MのNaOHを0.5mlを加えることによってDNAを脱ハイブリダイズ。それは一本鎖センスDNAが含まれているように溶出液を保持します。 ヌクレアーゼを含まない水で洗浄して調製脱塩カラムに0.5ミリリットルを追加することで、0.2M NaOH中のssDNAを脱塩。その後1ミリリットルヌクレアーゼを含まない水を追加し、この脱塩したssDNAサンプルを収集し、初期の0.5ミリリットル流体を捨てる。複数の脱塩カラムを使用すると、0.5mlずつの部分に必要とされる。 λ= 260nmでのUV吸収により溶出したDNAの濃度を決定する。 真空は、サンプルを乾燥させ、結合緩衝液の適切な容量の再構成。選択の次のラウンドのために取得した十分なDNAがなかった場合は、セクション4.6-4.9.2を繰り返します。 選択とシーケンシング5.その後のラウンド濃縮監視（4.1節）の結果に応じて選択条件のストリンジェンシーを調整します。一般的には、プールからの最も高い親和性バインダーを選択するために、連続した選択ラウンドで条件をより厳格にする。 注：これは、DNAの濃度を増加させる洗浄工程数、時間、または体積を増大させる、標的濃度が減少する負の選択化合物の濃度、または他の方法27の種々の増加との組み合わせを含む可能性がある。 標的分子のための配列の特異性を確実にするために、必要に応じて適切な制御を適用する。この作品では、システム（ 表1）3ラウンド開始し、選択を通じて濃度の増加に負の選択分子（プロゲステロン）を適用する。 （セクション3.7の前に）ビーズ上に固定化前に10〜20μMのプロゲステロンと30分間プレインキュベートDNAプール、ラウンド11で起動する。 </LI> 最大の濃縮が観察された後、捕捉プローブの長さを増やします。 互換性のあるプライマーと高忠実度ポリメラーゼによるPCR増幅による配列決定のために最大限に濃縮された（ラウンド13）と最小限濃縮（ラウンド6）の条件を表す最終プール（ラウンド15）と他のプールを準備します。 1Xの最終濃度を用いて、50μlの反応容量（反応バッファー）、200μM（各dNTP）、400 nMの（各プライマー）、DNAプール、およびポリメラーゼ0.5μlの0.5μlのを設定します。サイクルは、最後の伸長のために72℃で7分間保持を除いて、同じPCR条件を使用して、セクション4.5に記載されている手順を使用して、ラウンドごとに最適化します。 徹底的に非接着ラップで密閉キャップでマイクロ遠心チューブにシークエンシング施設に準備されたプールの50μLを送信します。プチプチと船のO / Nシング施設へアイスパックとが充填された15ミリリットルコニカルチューブにチューブを置きます。 </ol> シーケンスされたプール（複数可）の濃縮を評価するために、各配列のコピー数を決定します。 シーケンシング機能によって提供されるすべてのプールのデータで繰り返さ各シーケンスの頻度/コピー数を決定するために、FASTA形式で次世代シーケンシングデータのための手順を（補助コードファイルを参照してください）​​ソート/コード·ライティングを使用します。 最高コピー数系列の特異性と親和性を分析します。相互作用（タンパク質または小分子）、結合時にアプタマーの構造特性、及び予想される親和性のタイプが適切である方法が決まります。このトピックでは、参考文献1,28-30の数にさらに詳細に検討されている。 6. AuNP合成と検出クエン酸還元法21を用いてAuNPsを合成する。沸騰への50mMのHAuCl 4と熱の2ミリリットルでミリポア水の98ミリリットルを混ぜる。 として38.8 mMクエン酸ナトリウムの10ミリリットルを追加します。すぐに逆流が始まると。色は、数分後に赤色に変わります。熱をオフにして20分間溶液を攪拌し続けます。 AuNP溶液は0.2μmのポリエステル膜でろ過後、室温まで冷却させる。暗い琥珀色の瓶の中にすべてのAuNP懸濁液に保管してください。 2.4×10 8 Lモル-1 cm -1で31の吸光係数を用いて、UV吸収によってAuNP濃度を計算する。濃度が21を動的光散乱によって決定される17±0.6程度の大きさで、この作業に10 nMであった。 アルミホイルで保護され、周囲条件で1時間10 nMのAuNPでDNAをインキュベートします。 AuNPの体積は全ての所望の試験を実施することを可能にするのに十分な解決策を提供することが異なり（〜1〜2ミリリットル）。 73のローディング密度、120、及び200 D / NP（AuNPあたりDNA分子）本研究で検討した、体積および濃度に応じて変化するであろう。 HEPを用いて、1：DNAを希釈/ AuNP溶液1ES緩衝液（20mM HEPES、2mMのMgCl 2を 、でpH = 7.4）。混合物をアルミホイルでカバーRTで平衡化することを許可する。 注：このステップに必要な時間は、研究者によって最適化される必要がある。この研究では、数分からO / Nの範囲の時間を調べた。 DMSO中の100mMでの分析物（コルチゾール、コール酸、2-メトキシ）ストック溶液を準備し、アルミホイルでカバーしています。バッファー（2.1節）を結合コルチゾールの1/3希釈さ100μmに株式の希釈によって各実験の前に新鮮な初期解を行います。さらに1/3の結合緩衝液を用いて、初期溶液を希釈するように、目標の一定量（10μl）を、濃度範囲を生成するために添加される。 1/3の結合緩衝液10μlのDNA / AuNP溶液80μLを添加することにより、必要な塩濃度の最適化（「ブランク」と呼ばれる）。 その後のNaCl solutの異なるボリュームを追加RTで20分間インキュベートイオン。塩の添加（この作品で使用されるの1M NaCl 13-40μL）の後に青の色相に向かってかろうじて視覚的に顕著な変化を誘導し、塩のボリュームを探します。これは良い出発点を提供しますが、ターゲット·追加を含めた結果、以下のさらなる調整が必要な場合があります。 対象溶液10μlのDNA / AuNP溶液を80μLを組み合わせて、室温で20分間インキュベートする。常にブランク（6.8節）を含め、同時に複数の標的濃度を分析するために、96ウェルプレートおよびマルチチャンネルピペットを使用しています。 NaCl溶液の適切な量（1 M NaClを13μlのこの作業に適用された）を追加し、直ちにプレートリーダーを用いて650と530 nmの吸光度を分析する。 ブランク測定の目標濃度に対して正規化対吸光度値の比（E 650 / E 530）として結果をプロットする。