Culture et co-culture de souris ovaires et follicules ovariens

Tous les travaux des animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles sous licence par le Home Office du Royaume-Uni (numéro de licence du projet PPL 60/1726 et 60/4026). Remarque: animaux Maison conformément aux exigences légales du Royaume-Uni dans une lumière 14 h et 10 h photopériode sombre. Mener des expériences sur les animaux utilisant des souris de C57BL6J de type sauvage, les souris Tau-GFP qui ont une expression ubiquitaire de la protéine fluorescente verte (GFP) 8, et les souris Thy1-YFP avec l'expression occasionnelle de la protéine fluorescente jaune (YFP) dans un sous-ensemble de cellules neuronales neuf: deux lignées transgéniques ont été élevés sur un fond C57BL6J. 1. Conditions de travail et préparation des instruments Effectuer la préparation de tous les médias, les dissections de tissus, et le travail de la culture dans une hotte à flux laminaire pour assurer la stérilité: cela évite l'exigence de l'ajout d'antibiotiques aux médias. Toujours autoriser les médias / plaques de culture / plats d'embryons se équilibrerpendant au moins une heure, dans un four à 37 ° C (milieu de dissection / plats d'embryon) ou 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur (milieu de culture et plaques), avant l'utilisation. Faire tremper pipettes de verre dans une solution à 0,1% de sérum albumine bovine (BSA) pendant environ une heure, puis laisser sécher. Tirez pipettes dans la flamme d'un brûleur Bunsen, plier le verre comme vous le faites, pour produire des pipettes en verre incurvées finement dessinés. Après la pipette est tiré, faire une coupe nette avec un coupe-verre. Stériliser four à 160 ° C pendant environ 45 min. REMARQUE: Un magasin de ces pipettes en verre seront nécessaires pour transférer les ovaires et les follicules. 2. Préparation de la dissection et Culture Media Préparer Dissection moyenne. Dissoudre 3 mg / ml de BSA dans du milieu L15 Leibowitz et stériliser par filtration à travers un pore de 0,2 um, un filtre de 25 mm de diamètre. Néonatale Ovaire Culture. Pour préparer le milieu de la culture de l'ovaire néonatal, faire 1 ml de milieu pour each ovaire qui sera mis en culture. Dissoudre 3 mg / ml de BSA dans du α-milieu essentiel minimum (aMEM) et stériliser par filtration à travers un pore de 0,2 um, un filtre de 13 mm de diamètre dans un tube stérile. Pour préparer des plaques pour la culture de l'ovaire néonatal, ajouter 1 ml de milieu de culture néonatale ovaire dans chaque puits (un ovaire par puits) d'une plaque de 24 puits. En utilisant des pinces stériles horloger, placer une membrane de polycarbonate sur le dessus de la moyenne dans chaque puits de surface, brillant vers le haut. UV stériliser membranes avant utilisation. Follicule Culture. Pour préparer le milieu de culture de follicules, milieu essentiel minimal supplément α-1 avec UI / ml d'hormone folliculo-humain recombinant stimulant, 5 ug / ml d'acide ascorbique et 5% v / v de sérum obtenu à partir de souris femelles adultes. Stériliser par filtration à travers un pore de 0,2 um, un filtre de 13 mm de diamètre dans un tube stérile. Stériliser par filtration de l'huile de silicium à travers un filtre de 0,45 um pores, diamètre 25 mm, dans un tube stérile. Pour préparer plaTES, placez 30 gouttes ul de milieu de culture des follicules dans chaque puits d'une culture non-tissu traité 96 puits Microplaque ronde ainsi, en utilisant uniquement la rangée supérieure de chaque plaque (pour permettre follicules à être déplacés dans de nouvelles lignes chaque jour plus la période de culture). Superposer soigneusement milieu avec 70 ul d'huile de silicone stérilisée, pour empêcher l'évaporation milieu. Folliculo-ovaire Co-culture. Préparer le milieu de co-culture folliculo-ovaire que pour la culture du follicule à l'étape 2.3.1 ci-dessus, faisant jusqu'à 1 ml de milieu pour chaque co-culture folliculo-ovaire étant mis en place. Pour préparer des plaques, ajouter 1 ml de milieu dans chaque puits d'une plaque à 24 puits. En utilisant des pinces stériles horloger, placer une membrane Nucleopore sur le dessus de la moyenne dans chaque puits de surface, brillant vers le haut. UV stériliser membranes avant utilisation. 3. néonatale Ovaire Dissection et de la culture Placer 1 ml de milieu de dissection dans chaque boîte d'embryon de verre stérile. <li> souriceaux nouveau-nés âgés de Cull jour postnatal 0 et 5, l'abattage par décapitation selon la réglementation UK Home Office. Saisir la peau qui recouvre la paroi abdominale à l'aide d'une paire de fines pinces à dissection et faire une grande incision dans la paroi de la peau et le corps. Tirez ouvrir l'incision de sorte tout l'abdomen est exposé. La vessie est généralement engorgé à ce stade et peut être percé pour faire la dissection plus facile. Déplacez les tripes de la façon dont l'aide de pinces de horloger. Suivre les cornes utérines de la vessie vers les reins de chaque côté. L'ovaire est situé juste en dessous du rein au sommet de l'utérus et apparaîtra comme une structure semblable à un nuage sous un microscope de dissection. Saisissez l'ovaire délicatement avec une pince horloger, et utiliser des ciseaux pour couper son attachement à l'utérus. Transférer la paire d'ovaires dans des plats d'embryons contenant du milieu de dissection préchauffé. Effectuer dissection fine des ovaires sous un microscope de dissection sur une sta chaufféege (37 ° C). Utiliser des aiguilles d'insuline pour rogner le sac de la bourse et de tout excès de matériau dont la trompe de Fallope, jusqu'à ce que l'ovaire reste. Transférer chaque ovaire dans le puits d'une plaque de culture préparé dans l'étape 2.2.2 ci-dessus, en utilisant une pipette en verre incurvée finement dessinée, un ovaire au-dessus de chaque membrane (voir la figure 1A). Culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Changer le support tous les deux jours. Utiliser une pipette d'échanger 50% du milieu dans chaque puits de pré-gazés milieu frais: placer la pointe de la pipette sur le bord du puits de milieu pour éviter de perturber la membrane. Maintenir cultures jusqu'à six jours. À la fin de la culture, de geler moyen et fixer ou de geler ovaires après un bref lavage dans PBS, comme l'exige. Fixer ovaires dans le fixateur de Bouin pendant 90 min pour l'analyse histologique, ou 10% du formol tamponné neutre pendant 90 min pour l'analyse immunohistochimique. Aligner geler ovaires par le tissu plaçant dansun tube en polypropylene, en plaçant le tube dans de la glace sèche pendant 5 à 10 min avant de le congeler à -70 ° C pour la protéine ou l'extraction ultérieure de l'ARNm. 4. folliculo Dissection et de la culture Cull souris femelles âgées de 19 à 23 jours de et isoler les ovaires. Mouiller la fourrure avec 70% d'éthanol avant de faire des incisions. Pincer la peau en utilisant une pince extrémités franches et de faire une grande incision dans l'abdomen avec des ciseaux de dissection, pénétrant à travers la peau et la paroi du corps. Déplacez l'intestin de la route en utilisant un ensemble plus fine des instruments de dissection et de localiser l'utérus. Suivre l'utérus jusqu'à l'ovaire, qui est situé au-dessous du rein, de chaque côté. Saisir délicatement l'ovaire en utilisant une paire de pinces horloger, rompre le ovaires attachement à l'utérus avec des ciseaux fins de dissection. Éviter de recueillir trop de coussinet adipeux de l'ovaire. Recueillir les ovaires et transférer dans des plats d'un embryon contenant du milieu de dissection préchauffé. Rédéplacer la bourse ovarienne en utilisant des aiguilles d'insuline pour rogner le sac de la bourse et de tout excès de matériau dont la trompe de Fallope, jusqu'à ce que l'ovaire reste. Environ réduire de moitié chaque ovaire en utilisant des aiguilles d'insuline. Soigneusement transférer chaque demi-ovaire dans un verre de montre individuel contenant 1 ml de milieu de dissection. Couvrir chaque verre de montre avec une lame de verre pour empêcher l'évaporation de milieu et d'assurer la stérilité. verres de montre de magasin contenant moitiés ovaire dans un four à 37 C ° jusqu'à ce que nécessaire, mais réaliser l'étape de dissection suivante dès que possible. Jeter tissus stocké de cette manière pendant plus d'une heure. Transfert verre de montre contenant une moitié de l'ovaire à un étage de microscope chauffé à 37 ° C sous une hotte à flux laminaire. Environ disséquer ovaire en gros morceaux à l'aide de deux aiguilles d'insuline, afin d'identifier les follicules pré-antraux fin de la façon suivante: il se agit contiennent 2-3 couches de cellules de la granulosa et ont un diamètre de l'ordre de 180 à 200 um. Disséquer manuellement tout iindéterminés follicules en utilisant une aiguille à l'insuline et une aiguille d'acupuncture 0,25 x 30 mm qui a été fixée dans un porte-aiguille. Veillez à éliminer la plupart du stroma entourant, mais éviter d'endommager la lame basale des follicules (voir la figure 1B). Utiliser une pipette en verre incurvé finement dessiné pour transférer attentivement follicules disséqués dans un verre de montre collecte contenant du milieu de dissection préchauffé. Veillez à garder les follicules dans la section de fin calibre de pipette pour éviter de perdre follicules. follicules Mesurer avec précision en utilisant un réticule de l'oculaire calibré monté dans un microscope à dissection. Sélectionnez follicules pour la culture que se ils mesurent 190 ± 10 m de diamètre. Sélectionnez d'autres seulement, les follicules sphériques sains pour la culture; elles sont translucides, sans zones sombres atrétiques, et ont une lame basale intacte, avec un peu de tissu thécale joint: jetez les follicules qui ne correspondent pas à cette description. On obtient un rendement compris entre 10-15 follicules par ovaire est bon. Utiliser une pipette en verre incurvé finement dessiné pour transférer un seul follicule dans le puits d'une plaque constituée comme à l'étape 2.3.3 ci-dessus. Placez soigneusement dans le follicule le fond du puits (et non dans la couche d'huile supérieure). Culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. follicules Culture pour un maximum de six jours, se déplaçant follicules dans un milieu frais et contenant tous les jours. Préparer la prochaine ligne de la plaque à 96 ainsi que dans la préparation de la plaque à l'étape 2.3.3 ci-dessus. Plaque Retour à l'incubateur pendant au moins une heure, pour permettre un équilibrage. Transfert follicules dans les puits de milieu frais, en utilisant une pipette en verre finement élaboré. Si à tout moment dans la culture follicules doivent être laissés pendant deux jours avant d'emménager dans un milieu frais, placer chaque follicule dans un minimum de 60 pi (plutôt que 30 pi) gouttelettes de milieu de culture de follicule. Pour recueillir des données sur la croissance du follicule, mesurer follicules quotidienne, en utilisant un eyepiece réticule monté dans un microscope à dissection. La couche d'huile fausser les mesures de diamètre du follicule, donc travailler sur le coefficient d'étalonnage pour le set-up. À la fin de la culture, de geler moyen et fixer ou geler les tissus pour une analyse ultérieure, comme dans l'étape 3.10 ci-dessus. Folliculo-follicule Co-culture. Culture follicules deux ensemble, pour étudier les interactions entre les follicules. La culture comme ci-dessus, mais deux follicules placer côte-à-côte, en contact, dans un puits. Passer gouttelettes de 100 ul de milieu de culture de follicules dans chaque puits d'une culture non tissulaire traitée microtitrage à 96 puits de plaque plate et, recouvrant milieu avec 100 ul d'huile de silicone stérilisée. Ne pas transférer follicules dans les puits fraîches comme dans l'étape 4.13 ci-dessus, mais au lieu d'utiliser une pointe de gel amende à changer 50% de la moyenne tous les deux jours. Afin d'identifier l'origine des tissus au sein de la co-culture, la co-culture de follicules chacun une source génétique différente, par exemple oNE de l'ovaire d'une souris de type sauvage, et l'autre de l'ovaire d'une souris avec une expression ubiquitaire de la GFP. Si l'on utilise la GFP ou YFP tissu, de minimiser l'exposition du tissu à la lumière, autant que possible, au cours de la culture, et à travers les étapes de fixation / traitement par la suite. NOTE: Il est normal que les deux follicules grandissent ensemble dans une seule unité 'deux follicule' (voir figure 1C). 5. folliculo-Ovaire Co-Cultures Disséquer les ovaires et les follicules sur que dans les sections 3 et 4 ci-dessus. Placer une ovaire néonatale sur une membrane, dans une plaque préparée comme dans l'étape 2.4.2 ci-dessus. Placez délicatement un seul follicule en contact avec un des pôles de l'ovaire néonatale, à l'aide d'une pipette en verre incurvé finement dessinée. Culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pour jusqu'à 5 jours. Afin de distinguer l'origine des tissus au sein de la co-culture, utiliser les ovaires et les follicules de deux différent poururces, par exemple une souris d'un type sauvage, et l'un d'une souris avec une expression ubiquitaire de la GFP. Remplacer 500 ul de milieu tous les jours comme à l'étape 3.8 ci-dessus, mais en utilisant un milieu de culture de follicules. Au cours de co-culture, le follicule devient souvent encapsulé par l'ovaire (figure 1D). À la fin de la culture, de geler moyen et fixer ou geler les tissus pour une analyse ultérieure, comme dans l'étape 3.10 ci-dessus. 6. Fixation, Immunocytochimie et imagerie du tissu cultivé À la fin de la culture, lavez le tissu dans du PBS et transfert à 100 pi (follicule) ou 1 ml (ovaire) de 10% du formol tamponné neutre, et fixer pendant 1 heure sur de la glace. Déplacez-vous dans trois lavages de 1x PBS à 4 ° C. Pour immunocytochimie sur les follicules, transfert entre puits d'une plaque de microtitration ronde et 96 puits en utilisant une pipette en verre incurvée finement dessiné, avec chaque puits contenant différents lavages ou traitements. Pour immunocytochimie sur Ovaries (ou follicule ovaire-co-cultures), intégrer dans un gel d'agarose à 4% et à l'article 50 um en utilisant un vibrotome. des sections de flotter dans le puits d'une plaque à 24 puits à appliquer des lavages ou traitements, retirer avec une pipette. Pour l'imagerie: transférer sections agarose sur des lames de verre plat et monter avec un milieu de montage; ou des follicules de transfert (ou complexes folliculo-follicule) à lames de verre de la cavité et monter avec non-durcissement milieu de montage. spécimens d'image en utilisant un microscope confocal.