JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
발생학

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

Published: April 12, 2015
doi:
10.3791/52410
, ,
1ReNeuron

Summary

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Abstract

תאי גזע עצביים (NSCs) מסוגלים התחדשות עצמית ובידול לתוך הנוירונים, האסטרוציטים וoligodendrocytes תחת microenvironments המקומית הספציפית. כאן, אנו מציגים סדרה של שיטות המשמשות לשלושה בידול ממדי (3D) וניתוח מירנה של קו משובט תאי גזע עצביים אנושיים (hNSC), כיום בניסויים קליניים עבור נכות שבץ (NCT01151124 וNCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs נגזרו מהשליש הראשון אדם קליפה עוברית אושרה אתית ותנאים הונצח באמצעות שילוב retroviral של עותק יחיד של c-mycER TAM לבנות. אנו מתארים כיצד למדוד תולדת תהליך האקסון של hNSCs המובחן על פיגומים וכיצד לכמת שינויים הקשורים בביטוי מירנה באמצעות מערך PCR 3D. יתר על כן אנו מדגימים אנליזה חישובית במטרה בחירת מירנה מטרות המשוערות. SOX5 וNR4A3 זוהו כיעד משוער מתאים מירנה של נבחר באופן משמעותי כלפי מטה-להסדירmiRNAs ד בhNSC המובחן. אימות יעד מירנה בוצעה על SOX5 ו3'UTRs NR4A3 ידי transfection פלסמיד הכתב הכפול וassay בלוציפראז הכפול.

Introduction

מחקר בתאי גזע ממלא תפקיד מרכזי ברפואת רגנרטיבית, שגם משתרעת על פני הדיסציפלינות של הנדסת רקמות, ביולוגיה של תא התפתחותיים, הרפוי סלולארי, ריפוי גנטי, וביו-חומרים (פיגומים ומטריצות). תאי גזע הם חשובים בשני תיקון רקמות developmentand האיבר; ההבנה כיצד תאי גזע לעבוד היא מרכזית לפיתוח טיפולי 1 תאי גזע חדשים המבוססים. CTX0E03 הוא תאי גזע עצביים שהונצחו על-תנאי אנושיים קו משובט, (hNSC) 2 מבודדים מהשליש הראשון אדם קליפה עוברית. CTX0E03 הגדיר מאפייני איכות שהם חיוניים לבנקאות סלולארי קלינית תחת תרגול טוב ייצור (GMP) 3. HNSCs באופן ספונטני יכול להתמיין לתאי עצב, גליה, וoligodendrocytes והוכח לשפר גירעונות נוירולוגיות כאשר הושתל במודל מכרסם של 2,4,5 איסכמיה מוקד. CTX0E03 hNSCs כרגע בניסויים קליניים לdisabil שבץity (NCT01151124 6 וNCT02117635, Clinicaltrials.gov).

יש לי miRNAs 22 נוקלאוטידים ממוצע באורך ומוכח מולקולות רגולציה 7, הם לא מקודדים חלבונים, אלא להיקשר 3 אזור ראש מתורגם (3'UTR) של mRNAs, המסדירים את יציבותם ותרגום לחלבונים. MiRNAs מדווחים להשתתף ברגולציה של מספר התהליכים תאיים, כוללים פיתוח, שגשוג, והבחנה 8. כמה miRNAs היה מעורב בויסות הגורל והמפרט של תאי גזע עצביים 9.

בשני ממדים (2D) סביבת תרבות סטנדרטית מורכבות סביבת in vivo לא התאימו, וכתוצאה מכך האינדוקציה והרגולציה של בידול hNSC אינה אופטימלית. בvivo, תאים מוקפים במייקרו-סביבה תלת ממדים (3D) שחובר על ידי אחר תאים וligands תאי, כולל רביםסוגי collagens, laminin, וחלבונים אחרים מטריצה ​​(חוץ-תאי, ECM). מחקרים קודמים דיווחו כי הטופוגרפיה האדריכלית של החומרים מחקת ECMS ופנוטיפ תא השפעת הגיאומטריה שלהם וגורל 10-15. מספר פיגומי 3D הזמינים מסחרי זמין; אנו משמשים פיגום קלקר נקבובי ביותר מהונדס עם ארכיטקטורה מוגדרת היטב ואחידה לקרום עבה 200 מיקרומטר המספק 3D שטח שאליו תאים יכולים לפלוש ולהבדיל 16-18.

מבחני בידול במסמך זה 2D and 3D משמשים כדי להעריך תולדת axonprocess. יתר על כן, אנו מתארים שיטה לפרופיל ביטוי מירנה של קו hNSC הכיתה קליני להמשיך לחקור תופעות מירנה על בידולה. השיטות לכאן מאוירות המבוססות על אלה שתוארו במקור ב -19.

Protocol

1. בידול HNSC על שלוש תרבות ממדי (3D) הערה: לבודד ולהפיק hNSCs, מרקמה אתית אושרה, שתוארה בפרסום קודם 2. אנא פעל על פי הנחיות האתיות ומוסדיות בעת ביצוע הליך זה. 1.1) 3D תרבות שימוש בצלחת 12 גם השתמש בטכניקת aseptic לאורך כל ההליך. בארון בטיחות ביולוגי, פיגומים מחדש מימה על ידי הוספת 2 מיליליטר / גם של 70% אתנול הוכנו באמצעות מים להשקיה (WFIr). הימנע מלגעת בפיגומים על ידי מחלק אתנול 70% במורד הקיר של כל אחד. בזהירות לשאוב אתנול 70% ולשטוף באופן מיידי את הפיגומים עם 2 מיליליטר / גם DMEM: F12 דקות 1. חזור על תהליך השטיפה פעמיים. בזהירות לשאוב DMEM: F12 לאחר השטיפה הסופית. פיגומי מעיל על ידי הוספת 2 מיליליטר / היטב laminin (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בDMEM: F12. דגירה צלחת על 37 מעלות צלזיוס ב5% זמזום CO 2חממת idified עבור מינימום של 2 שעות. את צלחת יש לשטוף עם DMEM החם: F12. זרע כל פיגום עם כ -500,000 hNSCs בהיקף של 150 μl של GFS RMM +. דגירה את הצלחת במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור humidified 5% כדי לאפשר לתאים להתיישב לפיגומים. להוסיף 3.5 מיליליטר של RMM לכל טיפול גם לוקח לא כדי לסלק תאים מפיגומים. דגירה את הצלחת למשך 7 ימים; להחליף בינוני RMM (3.5 מיליליטר / טוב) לאחר יום 1 (האכלה ראשונה) ושוב לאחר 2-3 ימים מההאכלה הראשונה. לאחר 7 ימים, להסיר בינוני ולתקן תאים עם paraformaldehyde 4% (PFA) עבור immunocytochemistry (ICC) או להוסיף 500 μl / טוב של מגיב תמוגה להפקת RNA כולל (צלחת חנות ב≤ -80 ° C או להמשיך לסך הפקת RNA) . 1.2) מדידת תולדה תהליך אקסון כתם PFA 4% קבועים hNSCs המובחן על פי פרוטוקול סטנדרטי ICC 20 β באמצעות3-טובולין נוגדן ראשוני זוהה עם נוגדנים משני מצומדות fluorochrome (TUBB3). גרעין תא Counterstain עם Hoechst (1 מיקרומטר). צלם תמונות נציג של תאים מוכתמים β3 טובולין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; לשמור תמונות כמו TIFF או JPEG. מדד של תולדת תהליך האקסון באמצעות כלי מדידת תוכנה (פלוס למשל-Pro תמונה). פתח את התמונה, אפשרות מדידות בחרו בסרגל הכלים, ובחר תכונת עקבות. כדי להפעיל את העקבות, בחר את נקודת ההתחלה בתולדת האקסון על ידי לחיצה על לחצן העכבר. צייר קו לאורך כל אורכו של האקסון תולדה; לחץ על זכות לסיים כל עקבות. חזור למדוד כל outgrowthswith האקסון בשדה הראייה. הגעה מדידות כפיקסלים או מיקרומטר (תלוי ועומד כיול להגדיר). מדידות אורך יצוא לתוכנת גיליונות אלקטרוניים לדוגמא ניתוח השוואתי וסטטיסטי. 2. ביטוי מירנה שימוש בתאי גזע ומסלולים התפתחותיים מערך מירנה PCR ממוקד 2.1) סך הפקת RNA מירנה לבצע חילוץ מירנה על פיגומים ודגימות 2D גדל (הבדיל ושליטה עברו התמיינות, hNSC). פיגומי הפשרה, הוכנסו בצלחת גם 12, אם נדרשו. לשלב תוכן תמוגה מגיב (500 μl) של 2 בארות באותו הצינור Eppendorf 1.5 מיליליטר, נפח סופי של 1 מיליליטר של מגיב תמוגה. תשמור על עצמך לעזוב את הפיגום בבאר. לדגימות שנאספו בעבר כיבשה תא pelleted 2D גדל (תרבויות hNSC 2D מובחנות ושליטה עברו התמיינות) להוסיף 1 מיליליטר של מגיב תמוגה ולהעביר תכנים לתוך 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. Homogenize כל דגימת בדיקה באמצעות מזרק 1 מיליליטר ומחט מד קצר 20 עד 25. להעביר את lysate דרך המחט באמצעות מזרק 1 מיליליטר עד 5 פעמים עד lysate הומוגנית מושגת. הוסף 200 μl של כלורופורם על צינור אחד Eppendorf וכובע בצורה מאובטחת. צינורות היפוך ומערבולתלערבב תוכן. צנטריפוגה כל homogenate המכיל 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge במשך 15 דקות ב≥12,000 x ז. מעביר את השלב המימי העליון של כל דגימה (להימנע מהעברה כל נוזל צבעוני הביניים, ורוד) לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge טרי המכיל 750 μl של 100% אתנול. מערבבים היטב על ידי היפוך. פיפטה עד 700 μl של כל מדגם בדיקה, כוללים כל משקע, לעמודת מיני בצינור איסוף 2 מיליליטר. סגור את המכסה וצנטריפוגות ב≥8,000 XG למשך כ -30 שניות בטמפרטורת חדר. מחק את הזרימה דרך. חזור על שלב זה באמצעות שאר המדגם. בצע תקציר DNA במשך 15 דקות. להוסיף RWT חיץ 700 μl לעמודה ו צנטריפוגות מיני לכ 30 שניות ב≥8,000 x ז. מחק את הזרימה דרך. לשטוף טור מיני-ידי הוספת הרשתית חיץ 500 μl וצנטריפוגה למשך כ -30 שניות ב≥8,000 x ז. מחק את הזרימה דרך. wash.Ce חזורntrifuge ב≥12,000 XG דקות 1 לייבש את הקרום נוסף. Elute RNA הכולל בצינור Eppendorf 1.5 מיליליטר על ידי הוספת 40 μl מים RNase ללא לעמודת המיני וצנטריפוגה 1 דקות ב≥8,000 x ז. למדוד כולל ריכוז RNA בעזרת ספקטרופוטומטר מתאים. 2.2) מירנה cDNA הכנה מכין את תערובת מאסטר ההפוך-שעתוק. כל דגימה דורשת 4 μl של חיץ 5x miScript HiSpec, 2 μl של תמהיל 10x nucleics, 2 μl miScript להפוך תערובת transcriptase. μl Aliquot 8 של תערובת השני בצינור PCR, להוסיף נפח הנדרש של רנ"א הכל (250 ng), ולהוסיף מים RNase ללא לנפח סופי של 20 μl. דגירה של 60 דקות ב 37 מעלות למשך 5 דקות C.Incubate על 95 מעלות צלזיוס כדי להשבית miScript ההפוך transcriptase Mix. הוסף 200 מים RNase ללא μl לתגובת כל 20 μl הפוך שעתוק, חנות ב -20 ° C, או להמשיך עם אמת-tiשלי PCR באופן מיידי. 2.3) בתאי גזע ומסלולים התפתחותיים ממוקדים מערך מירנה PCR מכין את תערובת רכיבי PCR בצינור 15 מיליליטר על ידי הוספת 1,375 μl של תערובת אמן הירוק 2x SYBR, 100 μl הכנת מירנה cDNA, 275 μl של 10x miScript יוניברסל פריימר, ו 1000 μl מים RNase ללא (סה"כ נפח 2,750 μl). העבר את תערובת רכיבי PCR על מאגר טעינת PCR. מוציא בזהירות את מערך הצלחת PCR 96-היטב מהשקית האטום שלה. להוסיף תערובת רכיבי PCR 25 μl היטב בכל מערך ה- PCR באמצעות pipettor 8 ערוצים, או pipettor 12 ערוצים באמצעות רק 8 טיפים. לשנות טיפים pipet הבאים כל שלב pipetting, כדי למנוע זיהום צולב בין הבארות. לאטום את צלחת עם סרט דבק אופטי, ו צנטריפוגות 1 דקות XG ב 1000 בטמפרטורת חדר (15-25 ° C) כדי להסיר בועות. ראייה לבדוק את הצלחת מתחת כדי להבטיח שאין בועות נמצאות בבארות. הנח את מערך ה- PCR 96 צלחת גם באת Cycler בזמן אמת. תכנית Cycler בזמן אמת בהתאם: מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ו -45 מחזורים במשך 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, ודקות 1 ב 60 ° C להגדיר (איסוף נתוני הקרינה) בודד. לייצא את ערכי ה- CT לכל הבארות לגיליון אלקטרוני Excel ריק לשימוש עם מערך PCR ניתוח נתונים תבנית Excel ותוכנה מבוסס אינטרנט. הערה: תוכנה זמינה בwww.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php. 3. חישובית ניתוח לחיזוי יעד מירנה ותיקוף היעד mRNAs על ידי Reporter פלסמיד Transfection וDdual בלוציפראז Assay. 3.1) חישובית ניתוח לחיזוי מירנה יעד עיון PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/) 21, אלגוריתם זמין באינטרנט לזיהוי miRNA למקד mRNAs תחזית. לחץ על "לחץ כאן לקבלת תחזית PicTar על בעלי חוליות". דף חדש ייפתח. בדף החדש, ממשק האינטרנט PicTar, לבחור מינים בתפריט הנפתח ולהכניס מירנה עניין בתיבת מירנה ID. לחץ על חיפוש עבור מטרות של מירנה. שים לב רשימה של mRNAs היעד מדורג על ידי ציון aPicTar. הערה: PicTar מחשב ציון המשקף את הסבירות שUTR נתון יהיה ממוקד על ידי מירנה נבחרה, ומבוסס על השלמת זרע, תרמודינמיקה וחיזוי קומבינטורית למטרות משותפות בקבוצות של miRNAs הביע שיתוף 22. באופן דומה לאחזר רשימה של mRNAs היעד באמצעות DIANA-LAB (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/) 23, וTargetScan (http://www.targetscan.org/) 24, על קו חלופי זמין אלגוריתמים. לקמפל טבלה השוואתית של מטרiRNAs מבוסס על דירוג שהושג באמצעות כלי תוכנה שונים. PicTar מדרג על ידי ציון, DianaLab ידי דיוק (המבוסס על יחס אות לרעש וציון דיוק להערכת המשמעות של התוצאות הצפויות), וTargetScan ידי PCT המצרפי (המבוסס על השלמת זרע, אנרגיה חופשיה של מחייב, שימור על מינים שונים), ראו טבלה 1. 3.2) תיקוף היעד mRNAs על ידי Reporter פלסמיד Transfection וDual בלוציפראז Assay. הערה: 3 כתבי לוציפראז UTR 'לאימות של יעד mRNA כבר תיארה בעבר 25. Transfection תאי הלה זרע בצפיפות של 10 5 תאים / גם בצלחת 24 גם. לאחר תאי הלה 24 שעות, שיתוף transfect עם 1.5 μl של מגיב transfection ושל NR4A3 3 פלסמיד UTR 'UTRor SOX5 3' או 100 ng, כמו גם 20 ננומטר מחקה מירנה (HSA-miR-96-5p לSOX5 3217; UTR, וHSA-miR-7-5p, וHSA-miR-17-5p לNR4A3 3 'UTR בהתאמה) בכל טוב. בארות שליטת Co-transfect עם NR4A3 3 UTRplasmid 'UTRor SOX5 3' וsiRNAs שליטה שלילית fluorochrome שכותרת. Transfection של בארות שליטה עם siRNAs שליטה השלילי fluorochrome שכותרתו מאפשר הערכה של יעילות transfection ומהווה סגוליות bind מירנה 3'UTR לחקות. מדידה של פעילויות בלוציפראז הכפולה למדוד את הפעילות בלוציפראז Firefly וRenilla לאחר transfection 24 שעות. הסר בינוני צמיחת תאים. הכן פתרון עובד אני על ידי הוספת 50 μl של מצע אני לתוך 10 מיליליטר של הפתרון אני; מערבב היטב. להוסיף 300 μl של פתרון עובד אני לכל 24 היטב. העבר את התוכן של כל 24 גם לתוך 3 בארות של צלחת לבנה 96, 100 μl כל אחד. חכה 10 דקות ולמדוד לוציפראז Firefly בסט luminometer לרכישת הארה. הכן solut עובדהיון השני על ידי הוספת 50 μl של המצע השני ל -10 מיליליטר של התמיסה II; מערבב היטב. הוספה של פתרון עובד לי 100 μl היטב לתוך כל אחד 96 כבר מכיל של I. פתרון עובד 100 μl חכה 10 דקות ולמדוד לוציפראז Renilla בסט luminometer לרכישת הארה. לחשב את היחס של הארה מלוציפראז Firefly ללוציפראז Renilla.

Representative Results

באיור 1 היא דמיינה את החקירה וכימות של בידול hNSC על פיגומי 3D לעומת תרבויות משטח שטוחות מסורתיות (2D) וexpressedas מדידות תולדת תהליך האקסון. באיור 2 היא representedthe זרימת עבודה ואת התוצאות לכימות מירנה שימוש בתאי גזע ומסלולים התפתחותיים התמקדו מערך מירנה PCR לחקור ביטוי ההפרש של miRNAs בhNSCs המובחן 2D and 3D לעומת שליטה מובחנת. ניתוח השוואתי בין מירנה הבאה hNSCs המובחן ובלתי-המובחן, ואנליזה חישובית לחיזוי היעד, SOX5 וNR4A3 (NOR1) זוהו כmRNAs יעד משוער. ללמוד אינטראקציה הישירה בין miRNAs והאתר המשוער שלהם על mRNA 3'UTR השתמשנו 2 פלסמידים זמינים מסחרי המכילים גם SOX5 או רצף NR4A3 3'UTR הוכנסו במורד הזרם של גן הכתב בלוציפראז גחלילית, nd המכיל באותו הגן בלוציפראז renilla פלסמיד לנורמליזציה. תוצאות הנציג של 3 פעילות לוציפראז 'UTR למטה ויסות מוצגות באיור 3. איור 1:. בידול של hNSCs על פיגומי 3D, ומדידה של תולדת תהליך es האקסון () בעקבות צביעת ICC סטנדרטית לβ3 טובולין (ירוק) וגרעינים counterstained עם Hoechst (כחול) microphotographs נציג נרכשו והמדידה של תהליכי האקסון היו בוצע בסיוע תוכנת ניתוח תמונה. (ב) תרשימים דיווח המדידה של תולדת תהליך האקסון שבוצעה בhNSCs המובחן 2D and 3D עבור 1 (1W) או 3 שבועות (3W).com / קבצים / ftp_upload / 52,410 / "target =" 52410fig1highres.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2:. עבודה סכמטי של פרופיל מירנה בhNSCs המובחן RNA סה"כ, כולל miRNAs, הופק משני hNSCs המובחן על פיגומי 3D ותרבויות 2D סטנדרטיים, או שליטה מובחנת. 250 ננוגרם של רנ"א הכל היה עם שיטה המאפשרת את ההמרה סלקטיבית של miRNAs הבוגר לcDNA המתאים לכימות מירנה עם התמיינות תאים אנושית ופיתוח מערך miScript מירנה PCR-עיבד רטרו. גיאו-הממוצע של SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, וRNU6-2 שימש לניתוח נתונים המבוסס על שיטת 2 -ΔΔct. שינויים משמעותיים הוגדרו כ+/- 1.5 לקפל למעלה ולמטה רגולציה לstaבמידת tistically משמעותית. הנתונים נותחו באמצעות תוכנה מבוססת אינטרנט זמינה בתוצאות באות לידי ביטוי כclustergram. שונה מאיור 3 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: אימות של יעד מירנה חזתה mRNA באמצעות assay דו"ח לוציפראז כפול. תרשים נציג של פלסמיד כתב בלוציפראז כפול משמש ככלי כדי לאמת את רצף 3'UTR כמטרה ישירה של מירנה (). (ב) מיקרוסקופ נציג מראה יעילות transfection. (C)   אותות, הביעו כפעילות לוציפראז היחסית, בין 3 & # אדם39; גני כתבי UTR ofSOX5 וNR4A3 הופלו באופן משמעותי כלפי מטה בנוכחות HSA-miR-96, וHSA-miR-7 ו -17 מחקה מירנה בהתאמה. שונה מאיור 5 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. DIANALAB PicTar TargetScan מירנה גן המטרה אתרי יעד / גנים שנמצאו Precision ציון המצרפי P CT HSA-miR-96 SOX5 1214/763 1 6.74 <td> 0.94 HSA-miR-183 DUSP10 302/190 0.72 4.75 0.85 HSA-miR-302a NR4A3 863/473 0.84 3.05 NF HSA-miR-182 FOXN3 1358/794 0.94 NF 0.96 HSA-miR-7 NR4A3 NF NF 1.61 0.17 HSA-miR-7 FOXN3 399/136 0.17 NF 0.88 HSA-miR-20a NR4A3 1650/841 0.85 5.87 0.63 <strong> HSA-miR-20b NR4A3 1955/973 0.9 5.87 0.63 HSA-miR-17 NR4A3 1928/961 0.9 5.38 0.63 + 0.37 HSA-miR-20a EIF4G3 1650/841 0.97 NF NF HSA-miR-20b EIF4G3 1955/973 0.94 NF NF HSA-miR-17 EIF4G3 1928/961 0.94 NF NF טבלת 1: רשימה של mRNAs חיזוי יעד מירנה. שולחן נציג של miRNAs, למקד את הגנים חזוי, וניתוח אלגוריתמים (לחזותיון / ציון / כולל הניתן באמצעות המעבדה דיאנה, PicTar, וTargetScan בהתאמה). שונה מטבלה 3 19.

Discussion

הפיתוח חדש במבחני חוץ גופית על מנת להעריך ולשפר את ההתמיינות של תאי גזע תמיד הציג אתגר לחקירת הפונקציות שלהם והיכולות טיפוליות. לטווח ארוך ויציב של קובץ מצורף hNSCs, הנדרש לפיתוח של 3D חזק בassay בידול מבחנה, טופל על ידי בדיקת מספר מצעי 3D עם מאפיינים שונים בטווח של חומרים ומבנים. כחלק מפיתוח assay אנחנו גם הערכנו ריכוז זריעת תאים אופטימלי וזיהינו את הדרישה לפיגומים להיות מצופים laminin. למרות hNSCs שלנו באופן ספונטני יכול להבדיל על 4-OHT והסרת גורם גדילה, יישום מערכת תרבות 3D הראו שיפור משמעותי ביכולת הבידול שלהם כפי שהיא נמדדים על ידי תולדת תהליך האקסון בהשוואה לhNSCs 2D המובחנת הסטנדרטי.

כדי לחקור את ההשפעה של differe 3D המושרהntiation על ביטוי hNSC מירנה השתמשנו מערך PCR. לעומת microarray שבב סטנדרטי מערך PCR מציע את היתרונות של כימות ואימות ישירות של מירנה עניין. למרות שמערך ה- PCR מוגבל בטווח של מספר הכולל של מירנה בכל מערך, למשל כאן פחות מ -96, זה יכול להיות מותאם לכולל במיוחד miRNAs של עניין, במקרה שלנו שדווח בעבר בפיתוח תאי גזע. הביטוי של miRNAs מסלול ממוקד היה צדודית בhNSCs המובחנת 3D ו 2D לעומת hNSCs מובחן. MiRNAs באופן משמעותי ביותר למטה מוסדר נבחרו ונותח להעריך mRNAs היעד המשוער שלהם במטרה לקבוע את הפונקציונליות שלהם ופרשנות ביולוגית באמצעות אלגוריתמים זמינים באינטרנט (Lab דיאנה, PicTar, וTargetScans).

מירנה אחד יכולה לזהות מאות יעדים ומסיבה זו אנו תוקף אינטראקציות מירנה עם 3 'UTR mRNAsthat עשוי להיות מועמדים מתאימים בהרגולציה xonal. NR4A3, יעד של HSA-miR-7, וmiR-17 משפחתי, הוא חבר של קולטנים הגרעיניים משפחת NR4A ש, תלוי ברמת ביטוי שלהם, מעורבים בהבחנה, ההישרדות, אפופטוזיס והרגולציה של האקסון בהיפוקמפוס הדרכת 26. באופן דומה SOX5, יעד של HSA-miR-96, הוא דיווח לשלוט התקדמות מחזור התא בתאי אב עצבי 27 אורך האקסון 28, הגירה, בידול פוסט-נודד, ותחזיות של נוירונים 29. SOX5 וNR4A3 שני זוהו כmRNA יעד ישיר של HSA-miR-96, וHSA-miR-7 ו -17 בהתאמה על ידי מבחני כתב בלוציפראז כפולים. לוציפראז הכפול (Firefly וRenilla) מסתמך על שני גני כתב שונים באותה פלסמיד ומציע מערכת משופרת המאפשרת נורמליזציה לאפקטים הנגרמים על ידי transfection לא טוב ואפקטים רעילים לתאים בהשוואה למערכת פלסמיד בלוציפראז יחידה. כחלק מפיתוח assay שלנו אנחנו גם מותאמים conditi transfection שלנותוספות על מנת לקבל יעילות גבוהה.

Protocolsdescribed במסמך זה עשוי להיות מנוצל כדי לייעל עוד יותר ולאפיין בידול במבחנה hNSC אשר עשוי beimplemented פרוטוקולי intransplantation ללימודי קדם-קליניים ויישומים קליניים בעתיד.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים ג'ולי Heward על עזרה בהכנת hNSCs, וLavaniya Thanabalasundaram לתמיכה הטכנית שלה עם culturing הלה וtransfection.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).
  2. Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).
  3. Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).
  4. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).
  5. Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).
  6. Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
  9. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).
  10. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).
  11. Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).
  12. Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).
  13. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  14. Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).
  15. Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).
  16. Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
  17. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
  18. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
  19. Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).
  20. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  21. Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).
  22. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  23. Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).
  24. Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120 (1), 15-20 (2005).
  25. Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3’UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
  26. Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).
  27. Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).
  28. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).
  29. Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).

Tags

Human Neural Stem Cells3D CultureDifferentiationMicroRNATarget GenesSOX5NR4A3Axon OutgrowthMiRNA ExpressionComputational AnalysisDual Luciferase Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image