Différenciation d'un Neural Stem Cell humaine ligne sur Trois Cultures dimensionnelles, les gènes Analyse des microARN et Putative cibles

1. différenciation HNSC sur tridimensionnelle (3D) Culture REMARQUE: Isoler et tirer hNSCs, à partir d'un tissu approuvé éthique, décrit dans une publication précédente 2. Se il vous plaît suivre les lignes directrices éthiques et institutionnels tout en suivant cette procédure. 1.1) 3D culture en utilisant 12 puits Plaque Utiliser une technique aseptique pendant la procédure. Dans une enceinte de sécurité biologique, réhydrater les échafaudages en ajoutant 2 ml / puits de 70% d'éthanol préparés avec de l'eau pour l'irrigation (WFIr). Evitez de toucher les échafaudages en distribuant l'éthanol à 70% dans la muraille de chaque puits. Aspirer soigneusement le éthanol à 70% et se laver immédiatement les échafaudages avec 2 ml / puits DMEM: F12 pendant 1 min. Répéter deux fois la procédure de lavage. Aspirer soigneusement le DMEM: F12 après le lavage final. Manteau échafaudages en ajoutant 2 ml / puits de la laminine (10 pg / ml) dans du milieu DMEM: F12. Incuber la plaque à 37 ° C dans un CO 2 hum 5%idified incubateur pendant au moins 2 heures. Laver la plaque avec du DMEM chaud: F12. Ensemencer chaque échafaud avec environ 500 000 hNSCs dans un volume de 150 pi de RMM + GF. Incuber la plaque pendant 3 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié 5% pour permettre aux cellules de se installer dans les échafaudages. Ajouter 3,5 ml de RMM à chaque prenant bien soin de ne pas déloger les cellules à partir des échafaudages. Incuber la plaque pendant 7 jours; remplacer à moyen RMM (3,5 ml / puits) après un jour (la première alimentation) et à nouveau après 2-3 jours de la première tétée. Après sept jours, éliminer le milieu et fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) pour immunocytochimie (ICC) ou ajouter 500 ul / puits de réactif de lyse pour l'extraction de l'ARN total (plaque de stocker à ≤ -80 ° C ou de procéder à l'extraction de l'ARN total) . 1.2) Mesure de Axon processus Excroissance Tache PFA 4% fixé hNSCs différenciées selon un protocole type CCI 20 en utilisant de β3-tubuline (TUBB3) d'anticorps primaire détectée avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome. Noyaux cellulaires Counterstain avec Hoechst (1 uM). Capturez des images représentatives de cellules colorées β3-tubuline en utilisant un microscope à fluorescence; enregistrer des images au format TIFF ou JPEG. Mesure de processus de croissance axonale aide d'un outil de mesure du logiciel (par exemple Image-Pro Plus). Ouvrez l'image, sélectionnez l'option des mesures dans la barre d'outils, et sélectionnez la fonction de trace. Pour démarrer la trace, sélectionnez le point de départ sur l'excroissance des axones en cliquant sur le bouton de la souris. Tracer sur toute la longueur de l'excroissance des axones; clic droit pour terminer chaque trace. Répétez l'opération pour mesurer toute outgrowthswith des axones dans le champ de vision. Exprimez-mesures comme des pixels ou pm (en attendant l'étalonnage mis en place). les mesures de longueur de l'exportation vers un tableur pour l'analyse comparative et statistique échantillon. 2. Utilisation d'un miARN Expression cellules souches etVoies de développement ciblée tableau miRNA PCR 2.1) miRNA extraction de l'ARN total Effectuer l'extraction miRNA sur des échafaudages et des échantillons cultivés 2D (différenciés et non différenciés, le contrôle hNSC). Échafaudages dégel, insérés dans une plaque à 12 puits, si nécessaire. Combinez les contenus de réactifs de lyse (500 pi) de deux puits dans le même tube Eppendorf de 1,5 ml, volume final de 1 ml de réactif de lyse. Prenez soin de laisser l'échafaud dans le puits. Pour 2D grandi échantillons prélevés antérieurement secs granulés cellulaires (cultures hNSC 2D différenciées et de contrôle indifférencié) ajouter 1 ml de réactif de lyse et transférer le contenu dans 1,5 ml microtube. Homogénéiser chaque échantillon d'essai en utilisant une seringue de 1 ml et une aiguille de calibre 20 à 25 court. Faire passer le lysat à travers l'aiguille en utilisant une seringue de 1 ml jusqu'à 5 fois jusqu'à ce qu'un lysat homogène. Ajouter 200 pi de chloroforme à chaque tube Eppendorf et bouchon. Inverser tubes vortex et àmélanger le contenu. Centrifugeuse contenant chacun de 1,5 ml homogénat de microtube pendant 15 min à ≥12,000 x g. Transférer la phase aqueuse supérieure de chaque échantillon (éviter de transférer toute interphase, rose liquide de couleur) à un tube de 1,5 ml frais contenant 750 pi d'éthanol à 100%. Mélanger soigneusement par inversion. Pipeter jusqu'à 700 ul de chaque échantillon d'essai, y compris tout précipité, en une mini colonne dans un tube collecteur de 2 ml. Fermer le couvercle et centrifuger à ≥8,000 g pendant environ 30 secondes à la température ambiante. Jeter le accréditives. Répéter cette étape en utilisant le reste de l'échantillon. Effectuer un condensé ADN pour 15 min. Ajouter 700 ul RTT tampon au mini colonne et centrifuger pendant environ 30 secondes à ≥8,000 x g. Jeter le accréditives. Laver mini-colonne en ajoutant 500 pi de tampon RPE et centrifugation pendant environ 30 secondes à ≥8,000 x g. Jeter le accréditives. Répétez wash.Centrifuge au ≥12,000 g pendant 1 min à sécher la membrane plus loin. Eluer l'ARN total dans un tube Eppendorf de 1,5 ml en ajoutant 40 ul d'eau exempte de RNase à la mini-colonne et la centrifugation pendant 1 min à ≥8,000 x g. Mesurer la concentration de l'ARN total à l'aide d'un spectrophotomètre approprié. 2.2) ADNc miRNA Préparation Préparer le mélange maître inverse de transcription. Chaque échantillon nécessite 4 pi de tampon 5x miScript Hispec, 2 pi de 10x nucleics mélange, 2 pl miScript transcriptase inverse mélange. Aliquote 8 pi de mélange maître dans un tube PCR, ajouter du volume requis de l'ARN total (250 ng) et ajouter de l'eau exempte de RNases à un volume final de 20 pi. Incuber pendant 60 min à 37 ° C.Incubate pendant 5 min à 95 ° C pour inactiver la transcriptase inverse miScript Mix. Ajouter 200 eau libre de RNase-ul à chaque réaction 20 pi transcription inverse, conserver à -20 ° C, ou de procéder avec de la vraie-time PCR immédiatement. 2.3) Les cellules souches et les voies de développement ciblé tableau miRNA PCR Préparer le PCR composants mélange dans un tube de 15 ml en ajoutant 1 375 pi de 2x SYBR maître vert mélange, 100 ul miRNA ADNc préparation, 275 pi de 10x Primaire universel miScript et 1000 ul d'eau sans RNase (volume total de 2 750 pi). Transfert PCR composants mélange sur un réservoir de chargement PCR. Retirez délicatement le 96 puits tableau plaque PCR de son sac scellé. Ajouter 25 ul composants de mélange PCR dans chaque puits de la matrice PCR en utilisant une pipette à 8 canaux, ou d'une pipette 12 canaux avec seulement 8 conseils. Changer conseils pipette après chaque étape de pipetage pour éviter la contamination croisée entre les puits. Sceller la plaque avec un film adhésif optique, et centrifuger pendant 1 min à 1 000 g à température ambiante (15-25 ° C) pour éliminer les bulles. Inspecter visuellement la plaque de dessous pour se assurer qu'aucun des bulles sont présentes dans les puits. Placez le tableau PCR 96 de la plaque et dans le temps réel cycleur. Programme en temps réel en conséquence cycleur: 1 cycle à 95 ° C pendant 10 min, et 45 cycles pour 15 s à 95 ° C, et 1 min à 60 ° C réglé une seule (la collecte des données de fluorescence). Exporter les valeurs de Ct pour tous les puits à une feuille de calcul Excel vide pour une utilisation avec matrice PCR Analyse des données modèle Excel et le logiciel basé sur le Web. REMARQUE: Le logiciel est disponible au www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php . 3. Analyse computationnelle pour miRNA prévision cible et validation de la cible ARNm par Reporter plasmide transfection et Ddual Luciferase Assay. 3.1) Analyse informatique de prévision miRNA cible Parcourir PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, l'algorithme disponible en ligne pour l'identification de miRNA ARNm cible de prédiction. Cliquez sur "cliquez ici pour la prédiction PicTar sur les vertébrés". Une nouvelle page se ouvre. Dans la nouvelle page, interface web PicTar, choisir des espèces dans le menu déroulant et insérez miARN d'intérêt dans la zone miRNA ID. Cliquez recherche de cibles d'un miARN. Observez la liste des ARNm cibles selon leur indice de pointage aPicTar. REMARQUE: PicTar calcule un score reflétant la probabilité qu'un UTR donnée sera ciblée par le miARN choisi, et basé sur la complémentarité des semences, la thermodynamique et une prédiction combinatoire pour des objectifs communs dans des ensembles de miARN de co-exprimées 22. Liste des ARNm cibles récupérer même en utilisant DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23, et TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) 24, alternative en ligne disponible algorithmes. Compiler un tableau comparatif des mARNi basée sur le classement obtenu en utilisant différents outils logiciels. PicTar classe par le score, DianaLab par spécificité (basé sur le rapport signal sur bruit et un score de précision pour l'évaluation de l'importance des résultats prévus), et TargetScan par le PCT globale (basée sur la complémentarité des semences, Énergie libre de se lier, conservation plus espèces différentes), voir tableau 1. 3.2) Validation de la cible ARNm par Reporter plasmide transfection et Dual Luciferase Assay. NOTE: 3 'UTR reporters de luciférase pour la validation de la cible ARNm a été décrit précédemment 25. Transfection Semences cellules HeLa à une densité de 10 5 cellules / puits dans une plaque de 24 puits. Après 24 h, co-transfecter des cellules HeLa avec 1,5 ul de réactif de transfection et, soit 100 ng de plasmide NR4A3 UTR 3 'Utror SOX5 3', ainsi que 20 nM imite miRNA (hsa-miR-96-5p pour SOX5 3217; UTR, et HSA-miR-7-5p, et HSA-miR-17-5p pour NR4A3 3 'UTR respectivement) par puits. Puits de contrôle co-transfecter avec NR4A3 3 'Utror SOX5 3' UTRplasmid et fluorochrome marqué siRNA contrôle négatif. La transfection de puits de contrôle avec fluorochrome marqué négatifs siRNA de contrôle permet d'évaluer l'efficacité de transfection et représente synoptique miRNA 3'UTR spécificité de liaison. Mesure de la double activité luciférase Mesurer les activités de la luciférase de luciole et de Renilla 24 heures après transfection. Éliminer le milieu de croissance cellulaire. Préparer la solution de travail I en ajoutant 50 pl de substrat I dans 10 ml de solution I; bien mélanger. Ajouter 300 pi de solution de travail I dans chaque 24 puits. Transférer le contenu de chaque 24 bien dans trois puits d'une plaque blanche, 96 100 pi chacun. Attendre 10 min et mesurer Firefly luciférase dans le jeu de luminomètre pour l'acquisition de luminescence. Préparer solut travailion II par addition de 50 ul de substrat II dans 10 ml de solution II; bien mélanger. Ajouter 100 pi de solution de travail I dans chaque 96 puits contenant déjà 100 pi de solution de travail I. Attendre 10 min et mesurer la luciférase de Renilla dans le jeu de luminomètre pour l'acquisition de luminescence. Calculer le rapport de la luminescence de la luciférase Firefly à la luciférase Renilla.