Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

NOTA: Todos os experimentos são realizados de acordo com protocolos aprovados pelo cuidado e uso Comitê de animal Institucional da SingHealth. 1. A colheita precoce pós-natal mouse Brains Antes de dissecção, preparar o hipocampo solução digestão do tecido: papaína 10 ul por Solução Salina Equilibrada de 1 mL 1x de Earle (EBSS) (+ 1% de HEPES) com Desoxirribonuclease I (ADNase I) (250 U / ml) e Dispase II (1 L / ml). Adicione cerca de 2,5 ml da solução de digestão do tecido e filtrá-la usando uma unidade de filtro de 0.20 mm. Manter a solução quente a 37 ° C até à sua utilização. Anestesiar o pós-natais dia 5 (P5) filhotes de rato, colocando-os em gelo por 5 min. Retire do gelo e de teste para reflex dor via toe ou cauda pitada. Pulverizar os filhotes com 70% de etanol. Decapitar os filhotes e coloque as cabeças em uma placa de Petri com gelo. Realizar uma incisão na pele ao longo da linha mediana, a partir da base do crânio para o nariz, com um par de pequenas scissors ou fórceps de dissecação finos. Destaque a pele e fazer uma incisão semelhante através do crânio. Fazer dois cortes horizontais suplementares em cada lado do crânio, uma rostral (no bregma) e um caudal (no lambda). Peel abrir o crânio, ao longo das linhas de incisão para expor o cérebro subjacente. Utilizar um par de fórceps para remover o crânio que recobre os bulbos olfativos, e qualquer osso linha média entre elas. Faça isso, mantendo a cabeça estável, com uma pinça na mão não-dissecação. Aliviar a parte plana de uma espátula entre a parte ventral do cérebro e da base do crânio, na extremidade caudal. Mantendo a espátula paralelo à base do crânio, sob o cérebro, movê-lo no sentido da extremidade rostral do crânio para cortar quaisquer adesões entre o cérebro e da base do crânio. Colher o cérebro para fora com a espátula e coloca-se uma placa de Petri contendo gelada 1x EBSS (+ 1% de HEPES). Mantenha tecidos submersas em todos os momentos. Para todosetapas micro-dissecção, trabalho sob um microscópio de dissecação e usar um par de pinças de dissecação finas em cada mão, uma para corte de tecidos, e outra para segurar o tecido estável. Faça um corte imediatamente posterior ao córtex cerebral para separá-lo do cérebro posterior. O corte ao longo da linha média para separar o córtex cerebral nos seus dois hemisférios. Retire as meninges dos hemisférios cerebrais. Coloque um hemisfério lado medial e inserir a pinça no ventrículo lateral por baixo do hipocampo. Corte o mesencéfalo. Faça cortes nas extremidades superior e inferior do hipocampo, e perto da junção córtex denteado / entorrinal para isolar o hipocampo do córtex. Recolhe-se o hipocampo em um prato contendo gelada 1x EBSS (+ 1% de HEPES). 2. Hippocampal Dissociation Tissue Transferir o hipocampo para um prato que contém a solução de pré-aquecido a digestão de tecido de hipocampo. Mince tele tecidos do hipocampo para tão fina quanto possível e incubar durante 30 min a 37 ° C. Suavemente dissociar tecidos em células individuais por células de pipetagem e de transferência mecânicos para um tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 200 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 20 ml de 0,5x Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) contendo sacarose (0,9 M) e centrifugar a 200 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de meio de manutenção NPC (Tabela 1), colocado no topo de 10 ml de 4% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em solução 1X de EBSS e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e adicionar o meio de manutenção NPC rato (Tabela 1) ao sedimento de células. Pipeta suavemente para cima e para baixo 5-10 vezes para assegurar a pelete de células é dividida em células individuais. Transferir meio contendo as células em placas pré-revestidas de Matrigel e adicionar o factor de crescimento epidérmico (EGF) e fibroblafactor de crescimento de r 2 (FGF2) (ambos de 20 ng / ml) em heparina (5 mg / ml). Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2. 3. Manutenção de Adherent Rato Hippocampal NPCs Preparar as placas revestidas / frascos, pelo menos, uma hora antes da passagem em ratinho NPCs hipocampo. Adicionar Matrigel suficiente para cobrir a área de superfície de cada placa ou frasco e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Remova a mídia da 90% confluente rato culturas NPC e lavar uma vez com 1x tampão fosfato (PBS), em seguida, aspirar PBS off. Adicionar solução de separação celular suficiente para cobrir todos os poços / frascos e incubar durante 5 min a 37 ° C. Certifique-se de que todas as células têm destacado por olhar sob um microscópio de campo claro invertida em aumento de 10x. Se ainda houver células ligadas, incubar vaso de cultura durante mais 1-2 minutos e verifique novamente as células. Adicionar o dobro da quantidade de modificação F-12 Nutrient Mixture Eagle Medium / Ham Dulbecco (DMEM / F-12)que como solução de separação celular aos poços / frascos uma vez que todas as células têm destacado. Transferir DMEM / F-12 contendo células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio de manutenção de rato NPC (Tabela 1). Pipeta suavemente para cima e para baixo para quebrar agregado de células em células individuais. Placa de um terço do total de células em cultura nova poços / frascos e top-se meio de cultura suficiente suplementadas com EGF e FGF2. Incubar vasos de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2. Reabastecer médio a cada dois dias e dividir células 1: 3 a cada 3 a 4 dias. Evitar o crescimento excessivo de culturas rato NPC para evitar a agregação e desapego. 4. Diferenciação de Rato NPCs em astrócitos Prepare poli-L-lisina (PLL) / laminina revestido 12 milímetros óculos cobrir, pelo menos um dia de antecedência antes de iniciar a diferenciação dos NPCs do mouse em astrócitos. Adicionar coverslips em uma placa de 24 poços e cobrir toda a área de superfície de poços com suficiente PLL (1 mg / ml em tampão borato). Incubar a placa durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, retire PLL e lavar uma vez com 1x PBS. Adicionar laminina (1 mg / ml em DMEM frio de gelo / F-12), mais uma vez que cobre toda a área da superfície de cada poço, depois incubar durante pelo menos 4 horas a 37 ° C. Remova a mídia a partir de culturas de NPC do mouse e lavar uma vez com 1x PBS, em seguida, aspirar PBS off. Adicionar solução de separação celular suficiente para cobrir todos os poços / frascos e incubar durante 5 min a 37 ° C. Certifique-se de que todas as células têm destacado em seguida, adicione o dobro da quantidade de DMEM / F-12 como a de solução desprendimento de células para os poços / frascos. Transferir DMEM / F-12 contendo células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover as células sobrenadante e ressuspender em 5 ml de meio de diferenciação de astrócitos (Tabela 1). Gentilmente suspensio célula pipetan cima e para baixo para quebrar agregado de células em células individuais. Contar o número de células individuais com um hemocitómetro. As células em placas a 5 x 10 4 células / cm2 em 500 ul de meio para cada poço de uma placa de 24 poços. Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2. Substituir metade do meio com meio fresco a cada segundo dia. Rato NPCs diferenciar rapidamente em astrócitos prazo de 2 dias e são diferenciados por uma semana antes de iniciar novos experimentos. 5. colheita embrionárias de rato Brains e Cortical Dissociation Tissue Remover meio de diferenciação de astrócitos (Tabela 1) a partir de culturas de astrócitos e substitua com meio de neurónios primários (Tabela 1), pelo menos, 4 horas antes do início da colheita de cérebros de ratos embrionários. Antes de dissecção, preparar a solução de digestão do tecido cortical: 10 ul por 1 ml de papaína 1x EBSS (+ 1% de HEPES), com 12,1 mg / ml de L-cisteína. Adicione cerca de 20,5 ml da solução de digestão do tecido e filtrá-la usando uma unidade de 0.20 mm filtro. Manter a solução quente a 37 ° C até à sua utilização. Eutanásia da barragem grávida por asfixia dióxido de carbono utilizando gás comprimido. Teste para reflex dor via toe ou cauda pitada. Coloque o lado ventral animais acima em um pano absorvente e absorver a sua área abdominal com etanol 70%. Comprima a pele com um par de pinças e fazer uma incisão lateral com um par de tesouras cirúrgicas, suficientemente larga para expor o abdómen. Segure o peritônio com a pinça e cortar abrir a cavidade abdominal. Levante o corno uterino com a pinça e corte-o livre ao longo da mesométrio. Coloque o útero dissecado em uma placa de Petri com gelo. Separa-se cada embrião cortando o tecido uterino entre eles. Realizar uma incisão no saco embrionário. Gentilmente desembolsar o feto através da abertura. Decapitar o feto e colocar a cabeça em uma placa de Petri com gelo. Para colher embryonic cérebros de ratos, siga a descrição das etapas 1,3-1,5. Para dissecar tecidos corticais, coloque um hemisfério cerebral lateral, virada para cima. Corte o hemisfério em dois lateralmente a partir do meio. Descartar a metade mais próxima da base do cérebro. Apare o tecido extirpado para remover o mesencéfalo. Transfira os tecidos corticais a um prato que contém a solução de pré-aquecido a digestão do tecido cortical. Picar os tecidos corticais tão fina quanto possível e incubar durante 30 min a 37 ° C. Transferir os tecidos corticais a partir de solução de digestão de tecido para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 10 ml de meio primário neurónio pré-aquecido (Tabela 1). Dissociar os tecidos corticais por pipetagens repetidas los cima e para baixo em uma pipeta sorológica, até que uma solução homogénea, sem pedaços de tecido é obtido. Passe a solução de tecido através de um filtro de células 70 um para filtrar os restantes aglomerados de tecido. Alíquota da solução de tecido em 15 mltubos de centrífuga, adicionando cerca de 3 ml em cada tubo. Adicionar 800 uL de 7,5% de BSA em PBS 1x a parte inferior de cada tubo, formando duas camadas de tecido com a solução no topo e na parte inferior de BSA. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante, aspirando a partir da interface das duas camadas. Evitar perturbar o sedimento de células na parte inferior do tubo. Ressuspender cada pelete de células em 1 ml de meio de neurónios primários (Tabela 1) e combiná-los num tubo de centrífuga de 15 ml. Determinar a densidade de células utilizando um hemocitómetro. 6. Eletroporação e chapeamento de Primary neurônios corticais NOTA: A transferência de genes pode ser conseguida utilizando vários métodos, incluindo electroporação, transfecção com fosfato de cálcio e transdução virai. Neste protocolo, descrevemos eletroporação para entregar ChR2 construir em neurônios corticais primárias. Centrifugar 6 x 10 6 de rato neurónios corticais umt 200 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Pelo menos 6 x 10 6 neurónios corticais são necessários para electroporação para assegurar a formação de uma rede neuronal por neurónios sobreviventes. Adicione 100 ml de solução de eletroporação para a célula pellet e ressuspender delicadamente. Combinar 100 ul da suspensão de células com 6 ug de plenti-sinapsina-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmídeo e transferência para uma cuvete certificada. Evitar a produção de bolhas de ar durante a transferência. Selecionar e aplicar programa apropriado para eletroporação de acordo com as instruções do fabricante. Após a electroporação, adicionar 500 ul de MEM de suspensão de células / ADN para a cuvete. Transfira a amostra em 11,5 mL de meio de neurónios primários (Tabela 1) e ressuspender cuidadosamente. A quantidade total do material é suficiente para toda uma placa de 24 poços. Aliquota de 500 ul de meio para cada poço de uma placa de 24 poços. Incubar a placa a 37 ° C e 5% de CO 2. </ol> 7. Geração de pluripotentes induzidas Células-Tronco NOTA:. Este método foi adaptado de Okita et al 10 Culturas de fibroblastos humanos em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em placas de 6 poços. Antes de iniciar a reprogramação de fibroblastos, revestimento 6-poços com Matrigel e incubar durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Em 80% de confluência, remova a mídia da cultura de fibroblastos e lavar uma vez com 1x PBS. Adicionar suficiente 0,25% de tripsina-EDTA para cobrir toda a placa e incubar a 37 ° C durante 10 min. Uma vez que as células foram desalojadas dos poços, adicionar duas vezes a quantidade de meio DMEM com FBS a 10% que a de tripsina para extinguir a digestão de tripsina. Gentilmente pipeta de células em suspensão cima e para baixo para quebrar células. Contar o número de células individuais com um hemocitómetro. Transferência de 7 x 10 5 células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a suspensão de células a 200 xg durante 5min. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento de células em solução de electroporação. Electroporate os fibroblastos de acordo com as instruções do fabricante. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de electroporação e adicionar 1 ug de cada vector episómico. Células electroporate com configurações de 1.650 V, 10 ms e 3 pulsos de tempo. Suspensão de células de transferência em DMEM suplementado com FBS a 10% e a placa de 5 x 10 4 culas por po de uma placa de 6 poços. Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2. Após 48 horas, remover a mídia de cultura de fibroblastos transfectadas e coloque meio mTeSR. Substitua meios de cultura diariamente até células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) colônias estão prontos para ser isolado. IPSC colónias pode ser observada depois de 28-35 dias. Quando pronto para isolamento, cortado mecanicamente uma colónia iPSC e propagar novamente em meio mTeSR com 10 uM de Rho-associated protein quinase (ROCK) inibidor (Y-27632) sobre um revestimento de Matrigel placa de 6 poços 12. Substituir meio de cultura diária. 8. Neural indução e manutenção de NPCs Humanos NOTA:. Este método foi descrito por Li et al, 11 Quando as culturas iPSC são em torno de 20% de confluência, remova o meio mTeSR e substituir por meio de indução neural (Tabela 1). Reabastecer médio a cada segundo dia. Após 7 dias, retire meio de indução neural e coloque meio humano manutenção NPC (Tabela 1). Reabastecer médio a cada dois dias até 7 dias antes passaging culturas. Antes passaging culturas, placas de revestimento / frascos com Matrigel à temperatura ambiente durante, pelo menos, uma hora. Remova a mídia da confluentes culturas NPC humanos e lavar uma vez com 1x PBS, em seguida, aspirar PBS off. Adicionar solução de separação celular suficiente para cobrir todos os poços incubar durante 5 min a 37 ° C. Certifique-se de que todas as células têm destacado. Adicionar o dobro da quantidade de DMEM /F-12 como a da solução de separação de células para os poços / frascos. Transferir DMEM / F-12 contendo células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover as células sobrenadante e ressuspender em 5 ml de meio de manutenção humana NPC (Tabela 1). Gentilmente pipeta de células em suspensão cima e para baixo para quebrar células. Placa de um terço do total de células em cultura Matrigel revestidos poços / frascos e top up médio suficiente suplementado com 10 mM Y-27632. Incubar vasos de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2. Culturas de divisão 1: 3 a cada 3 a 4 dias e reabastecer meio todos os outros dias. Manter culturas NPC humanos em alta densidade para evitar diferenciação. 9. Diferenciação de NPCs Humanos em neurônios em co-culturas Adicione o vetor de lentivírus Synapsin1-tdTomato à cultura NPC humano antes de iniciar a diferenciação em neurônios. Prepare astrocyte / neurônio cortical co-culturasum dia de antecedência antes de diferenciar NPCs humanos. Lavar as culturas NPC humanos uma vez com PBS 1x e adicionar solução de separação celular suficiente para cobrir todos os poços / frascos depois incubar durante 5 min a 37 ° C. Certifique-se de que todas as células têm destacado. Adicionar duas vezes a quantidade de DMEM / F-12 como a da solução de separação de células para os poços / frascos. Transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover as células sobrenadante e ressuspender em 5 ml de meio de diferenciação neuronal (Tabela 1). Gentilmente pipeta de células em suspensão cima e para baixo para quebrar pellet celular em células individuais. Contar o número de células individuais com um hemocitómetro. Aspirar cuidadosamente meio de astrócitos / culturas de neurônios corticais. Placa NPCs humanos a 5 x 10 3 células / cm2 em 500 ul de meio de diferenciação neuronal (Quadro 1) suplementado com 10 ^ M Y-27632 para cada um de 24 poços. Delicadamente, adicionar meio contendo NPCs humanos em cada poçopara evitar incomodar os astrócitos e neurônios corticais. Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2. Substituir metade do meio com meio fresco a cada dois a três dias para, pelo menos, 28 dias. 10. As gravações eletrofisiológicas de neurônios iPSC derivadas Confirme se iPSCs humanos se comportam como neurônios maduros. Encontre células diferenciadas de iPSCs humanos por visualização de tdTomato usando um microscópio confocal vertical equipado com um 60X (0,9 NA) lente de imersão em água. Puxar a gravação pipeta para uma resistência de 4 a 6 células M. perfundir à temperatura ambiente em uma solução externa (Tabela 1) borbulhado constantemente com 95% de O2 / 5% de CO 2. Encher a micropipeta com uma solução de gravação interno (Tabela 1). Remendo tdTomato + celular no modo de células inteiras e ação registro potencial de queima em resposta a injeção de corrente (1 seg de duração, 10 incrementos PA) em curaluguel de grampo. Confirme se o potencial das células corticais que expressam ChR2 ação é evocado de forma confiável por estímulo luminoso. Encontre células corticais que expressam ChR2 pela visualização do GFP sob um microscópio confocal. Execute de célula inteira gravação patch clamp em células corticais seguindo os passos 10.1.2 a 10.1.3. Potencial de seleção ação é evocado de forma confiável por iluminação de luz com lâmpada de arco de mercúrio (100 W). O comprimento de onda do filtro de excitação é 480/40 nm. Realizar estimulação optogenetic. TdTomato remendo + célula no modo de célula inteira e definir voltage clamp em -70mV. Filtro de sinais de corrente em 2 kHz e digitalizar a 10 kHz. Monitorar resistências série que variam de 10 a 20 M para a consistência durante as gravações. Estimular a campo inteiro por 100 W filtro lâmpada de mercúrio com 480/40 nm de excitação durante 30 segundos. Correntes pós-sinápticos Grave (CSP) da célula remendada induzida por fotoestimulação de ChR2 expressando cor pré-sinápticoneurônios ticos. Detectar e medir unidades de atendimento. Definir limite de amplitude e área de correntes em 5 pA e 20 pc, respectivamente. Inspecionar manualmente esses eventos para descartar quaisquer vestígios não-PSC.