공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

참고 : 모든 실험은 SingHealth에서 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행된다. 1. 수확 초기 출생 후의 마우스 두뇌 1 ml의 1 배 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) (+ 1 % HEPES) 옥시 리보 뉴 클레아 제 I와 (의 DNase I) (250 U / ㎖) 및 스파 아제 (Dispase) II (1 U / 당 10 μL 파파인 : 해부하기 전에, 해마 조직 소화 용액을 제조 ㎖). 티슈 소화 용액을 약 2.5 mL로하고 0.20 μm의 필터 장치를 사용하여 필터링. 사용할 때까지 37 ° C에서 솔루션을 따뜻하게 유지. 5 분 동안 얼음을 넣어 출생 후 5 일 (P5) 마우스 새끼를 마취. 발가락 또는 꼬리 핀치를 통해 통증 반사 얼음 및 테스트에서 제거합니다. 70 % 에탄올로 새끼 스프레이. 새끼 목을 벨과 얼음을 페트리 접시에 머리를 배치합니다. 작은 scisso의 쌍, 코 두개골의 기지에서, 정중선을 따라 피부 절개를RS 또는 미세 해부 집게. 껍질은 피부를 열고 두개골을 통해 비슷한 절개를합니다. 두개골의 양쪽에 각각 2 개씩 추가 수평 절단, (브레 그마에서) 하나의 주동이와 (람다에서) 하나의 꼬리를 확인합니다. 껍질은 기본 뇌를 노출 절개 라인을 따라 두개골을 엽니 다. 후각 전구를 덮는 두개골, 그들 사이의 중간 선 뼈를 제거하는 포셉 한 쌍을 사용합니다. 비 해부 손에 집게의 쌍 안정의 머리를 들고있는 동안이 작업을 수행합니다. 뇌의 배쪽 부분 및 꼬리 단부에서 두개골의베이스 사이에 주걱의 평평한 부분을 편안. 뇌에서 두개골의베이스에 주걱 평행을 유지, 뇌와 두개골의 바닥 사이의 유착을 단절 두개골의 주동이의 끝으로 이동합니다. 주걱으로 뇌를 꺼내서 얼음처럼 차가운 1X EBSS (+ 1 % HEPES)를 포함하는 페트리 접시에 넣습니다. 항상 침수 조직을 유지합니다. 모든미세 절개 단계, 해부 현미경 작업 및 각 손에 미세 해부 포셉의 쌍을 사용하여, 조직을 절단 하나, 안정된 조직을 유지하기위한 다른. 컷 그냥 후뇌에서 분리하는 대뇌 피질 후부합니다. 두 개의 반구에 대뇌 피질을 분리하는 중간 선을 따라 잘라. 대뇌 반구에서 수막을 제거합니다. 반구 내측면이 위를 놓고 해마 아래 뇌실에 집게를 삽입합니다. 중뇌을 버려야. 해마의 우수한 열등한 끝에 상처를 확인하고 치아 / entorhinal 피질 접합 근처 피질에서 해마를 분리 할 수​​ 있습니다. 얼음처럼 차가운 1X EBSS (+ 1 % HEPES)를 포함하는 접시에 해마를 수집합니다. 2. 해마 조직 해리 예열 해마 조직 소화 용액을 함유하는 접시 해마 전송. 말하다 t그는 가능한 한 벌금 조직 해마, 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 조심스럽게 15 ㎖의 원심 분리 관에 기계적 피펫 및 전송 세포의 단일 세포로 조직을 떼어 놓다. 5 분 200 XG에서 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. 20㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛을 10 분 동안 200 XG에 수크로오스 (0.9 M) 및 원심 분리기를 포함하는 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 0.5X. NPC 유지 배지 (표 1) 2 ㎖로 상등액에 resuspend 세포 펠렛을 제거하고 5 분 동안 200 XG에서 1X EBSS 용액 및 원심 분리기에서 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 10 ㎖의 상부에 배치했다. 상층 액을 제거하고 세포 펠렛에 마우스 NPC 유지 보수 매체 (표 1)를 추가합니다. 부드럽게 피펫 5 ~ 10 배 아래로 세포 펠렛은 하나의 세포로 분해되어 있는지 확인 할 수 있습니다. 프레 코트 매트 리겔 플레이트에 배지를 함유하는 세포 이동 및 표피 성장 인자 (EGF) 및 추가 fibrobla헤파린 세인트 성장 인자 2 (FGF2) (모두 20 NG / ㎖) (5 ㎎ / ㎖). 37 ° C와 5 % CO 2에서 번호판을 품어. 자기편 마우스 해마의 NPC 3. 유지 보수 적어도 한 시간 전에 통과에 마우스 해마의 NPC에 코팅 된 플레이트 / 플라스크를 준비합니다. 각 접시 또는 플라스크의 표면 영역을 커버하고, 실온에서 1 시간 정도 배양 마트 리겔을 추가한다. 90 % 합류 마우스 NPC 문화에서 미디어를 제거하고 PBS를 대기음 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)로 한 번 씻는다. 모든 우물 / 플라스크를 커버하고 37 ℃에서 5 분 동안 배양 충분한 세포 분리 솔루션을 추가합니다. 모든 세포가 10 배 배율로 반전 밝은 필드 현미경으로 보면 분리했는지 확인하십시오. 여전히 부착 된 세포가있는 경우, 추가로 1 ~ 2 분 동안 배양 용기를 배양하고 다시 세포를 확인합니다. 둘 베코의 수정 이글 중간 / 햄의 F-12 영양소 혼합물의 두 배를 추가 (DMEM / F-12)우물에 세포 분리 솔루션의 AS / 플라스크 한 번 모든 세포를 분리했다. 5 분 동안 200 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 DMEM / F-12 포함하는 셀을 전송합니다. 마우스 NPC 유지 보수 매체 (표 1) 5ml에 뜨는에 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. 부드럽게 단일 세포로 세포 펠렛을 깨고 아래로 피펫. EGF와 FGF2와 보충 새로운 문화 우물 / 플라스크 및 상단까지 충분한 문화 매체에 총 세포의 세 번째 플레이트. 37 ° C와 5 % CO 2에서 배양 용기를 품어. 3 모든 3-4일 : 중간마다 둘째 날 및 분할 세포 1을 보충. 통합과 분리를 방지하기 위해 마우스 NPC 문화의 전면에 자라 난을 피하십시오. 성상에 마우스의 NPC 4. 차별화 성상 세포로 마우스의 NPC의 분화를 시작하기 전에 사전에 폴리 -L- 라이신 (PLL) / 라미닌 코팅 12mm 커버 안경 적어도 하루를 준비합니다. COV 추가24 웰 플레이트 erslips 충분히 PLL (보레이트 완충액에 1 ㎎ / ㎖)와 함께 웰 전체 면적을 커버. 4 ℃에서 하룻밤 접시를 품어. 다음 날, PLL을 제거하고 1X PBS로 한번 씻어. 다음, 37 ℃에서 적어도 4 시간 동안 배양, 다시 각 웰의 표면 전체를 덮고, (차가운 얼음 DMEM / F-12 1 ㎎ / ㎖)을 추가 라미닌. 마우스 NPC 문화에서 미디어를 제거하고 PBS를 대기음 1X PBS로 한번 씻어. 모든 우물 / 플라스크를 커버하고 37 ℃에서 5 분 동안 배양 충분한 세포 분리 솔루션을 추가합니다. 모든 세포가 다음 분리 된 DMEM / F-12 우물 / 플라스크에 세포 분리 솔루션과의 두 배를 추가했는지 확인하십시오. 5 분 동안 200 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 DMEM / F-12 포함하는 셀을 전송합니다. 5 ml의 성상 세포 분화 배지 (표 1)에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 조심스럽게 피펫 세포 suspensioN 위아래로 하나의 세포로 세포 펠렛을 깰. 단일 혈구 세포의 수를 계산. 5 × 104 세포 / cm 24- 웰 플레이트의 각 웰에 대한 매체 (500)의 2 μL 접시에서 세포. 37 ° C와 5 % CO 2에서 번호판을 품어. 격일로 신선한 매체와 매체의 절반을 교체합니다. 마우스의 NPC 빠르게 이일 내에서 성상 세포로 분화 및 추가 실험을 시작하기 전에 일주일 동안 차별화된다. 5. 수확 배아 쥐의 뇌와 두피 조직 해리 성상 세포 배양에서 성상 세포 분화 배지 (표 1)를 제거하고 차 신경 세포 배지 (표 1) 배아 쥐의 뇌의 수확을 시작하기 전에 적어도 4 시간으로 대체합니다. 12.1 ㎎ / ㎖의 L 시스테인과 함께 1 ml의 1 배 EBSS (+ 1 % HEPES) 당 파파인 10 μL : 해부하기 전에, 대뇌 피질의 조직 소화 용액을 제조. 약 2를 확인0.5 조직 소화 용액 ml의 0.20 μm의 필터 장치를 사용하여 필터링. 사용할 때까지 37 ° C에서 솔루션을 따뜻하게 유지. 압축 가스를 사용하여 이산화탄소에 의한 질식 임신 댐 안락사. 발가락 또는 꼬리 핀치를 통해 통증 반사에 대한 테스트합니다. 흡수 패드에 동물의 복부 측면을 놓고 70 %의 에탄올과의 복부를 흡수. 복부를 노출 충분히 넓은, 포셉 한 쌍의 피부를 조이고 외과 위의 쌍을 가진 횡 절개를합니다. 집게로 복막을 잡고 복강을 열고 잘라. 집게와 자궁 뿔을 들어 올려 mesometrium을 따라가 무료 잘라. 얼음을 페트리 접시에 해부 자궁을 놓습니다. 그들 사이의 자궁 조직을 절단하여 각각의 배아를 분리합니다. 배아 주머니에 절개를합니다. 조심스럽게 구멍을 통해 태아를 밖으로 껍질. 태아 목을 벨과 얼음을 페트리 접시에 머리를 배치합니다. embryon 수확IC 쥐의 뇌는 단계 1.3-1.5에서 설명을 따르십시오. , 대뇌 피질의 조직을 해부 뇌 반구 측면을 위로 올려 놓습니다. 중간에서 옆으로 두 반구를 잘라. 뇌의베이스 절반 가까이 버린다. 중뇌를 제거 절제 조직을 낸다. 예열 피질 조직 소화 용액을 함유하는 접시 피질 조직을 전송. 가능한 한 벌금 대뇌 피질의 조직을 말하다 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 예열 차 뉴런 배지 (표 1) 10 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 조직 소화 용액으로부터 대뇌 피질 조직을 전송. 어떤 조직 조각 균질 한 용액이 얻어 질 때까지, 혈청 학적 피펫에 반복적으로 그들을 피펫 팅에 의해 아래로 대뇌 피질의 조직을 떼어 놓다. 나머지 조직 덩어리를 걸러 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 조직 솔루션을 전달합니다. 15 ml의 조직으로 나누어지는 용액각 튜브에서 약 3 ㎖를 추가 원심 분리기 튜브,. 하단의 상단과 BSA의 조직 솔루션 두 개의 층을 형성, 각 튜브의 바닥에 1X PBS 800 ㎕의 7.5 %의 BSA를 추가합니다. 5 분 동안 200 XG에 원심 분리기. 두 층의 계면으로부터 흡입, 상청액을 제거한다. 상기 튜브의 하단에 세포 펠렛을 방해하지 않도록. 1 ml의 차 뉴런 배지 (표 1) 각각의 세포 펠렛을 재현 탁하고 15 ml의 원심 분리 튜브에 이들을 결합한다. 혈구를 이용하여 세포 밀도를 결정한다. 6. 일렉트로 및 도금 차의 두피 뉴런 주 : 유전자 전달은 일렉트로 인산 칼슘 형질 감염 및 바이러스 형질 도입을 포함한 여러 가지 방법을 사용하여 달성 될 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 ChR2 차 대뇌 피질의 신경 세포로 구성 제공하는 전기에 대해 설명합니다. 원심 분리기 6 × 10 6 쥐의 대뇌 피질의 뉴런5 분 200 XG를 t 상층 액을 제거합니다. 적어도 6 × 106 피질 뉴런 뉴런 생존하여 신경 네트워크의 형성을 보장하기 위해 필요한 전기. 펠렛을 세포 부드럽게 재현 탁하는 전기의 용액 100 μl를 추가합니다. pLenti-Synapsin-hChR2 6 μg의 (H134R) -EYFP-WPRE 4 플라스미드에 세포 현탁액 100 μl를 결합하고 인증 베트로 전송합니다. 전송하는 동안 공기 방울을 생산하지 마십시오. 선택과 제조업체의 지침에 따라 전기에 적합한 프로그램을 적용합니다. 전기 후, 큐벳에 세포 / DNA 현탁액에 MEM 500 μl를 추가합니다. 11.5 ml의에 차 신경 세포 배지 (표 1) 샘플을 전송하고 부드럽게 재현 탁. 미디어의 총량은, 전체 24- 웰 플레이트에 충분하다. 나누어지는 24 웰 플레이트의 각 웰에 대한 매체의 500 μL. 37 ° C에서 플레이트와 5 % CO 2를 품어. </OL> 유도 만능 줄기 세포의 7 세대 참고 :.이 방법은 오키타 등 알에서 적응되었습니다 (10) DMEM에서 배양 인간 섬유 아세포는 6 웰 플레이트에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 마트 리겔와 섬유 아세포, 코트 6 우물의 재 프로그래밍을 시작하여 실온에서 한 시간 이상 부화하기 전에. 80 % 합류, 섬유 아세포 배양에서 미디어를 제거하고 1X PBS로 한번 씻어. 전체 플레이트를 커버하고 10 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수있는 충분한 0.25 % 트립신 – EDTA를 추가합니다. 세포를 웰로부터 탈락되면 트립신의 트립신 분해를 종결로서, 10 % FBS DMEM으로 두번의 양을 첨가하는 것이 바람직하다. 부드럽게 아래로 피펫 세포 현탁액을 위로하고 세포를 파괴합니다. 단일 혈구 세포의 수를 계산. 15 ml의 원심 분리 튜브에서 원심 분리 5 200 XG에 세포 현탁액에 전송 7 × 105 세포분. 상층 액을 제거하고 전기 용액에 세포 펠렛을 재현 탁. 제조업체의 지침에 따라 섬유 아세포를 Electroporate. 전기 버퍼 100 ㎕의 세포를 재현 탁하고 각 에피 솜 벡터의 1 μg의를 추가합니다. 1,650 V의 설정, 10 밀리 3 시간 펄스와 Electroporate 세포. DMEM으로 전송 세포 현탁액을 10 % FBS 및 플레이트 6- 웰 플레이트의 웰 당 5 × 104 세포로 보충. 37 ° C와 5 % CO 2에서 번호판을 품어. 48 시간 후, 형질 전환 된 섬유 아세포 배양에서 미디어를 제거하고 mTeSR 배지로 교체합니다. 유도 만능 줄기 세포 (IPSC) 콜로니를 분리 할 준비가 될 때까지 매일 문화 미디어를 교체합니다. IPSC 콜로니 28~35일 후에 관찰 할 수있다. 때 격리를위한 준비, 기계적 IPSC 식민지를 잘라 마트 리겔 코팅 6 웰 플레이트 (12)에 10 μM의 Rho 관련 단백질 키나제 (ROCK) 억제제 (Y-27632)와 mTeSR 매체에 시드. 매일 배지를 교체합니다. 8. 신경 유도와 인간의 NPC의 유지 보수 참고 :.이 방법은 리 등에 의해 설명되었다 (11) IPSC 문화가 20 % 합류 주위에있는 경우, mTeSR 매체를 제거하고 신경 유도 매체 (표 1)로 교체합니다. 격일 매체 보충. 칠일 후에 신경 유도 매체를 제거하고 인간의 NPC 유지 보수 매체 (표 1)로 교체. 문화를 계대 7 일 전으로 매체마다 두 번째 날을 보충. 이전에 적어도 시간 동안 실온에서 마트 리젤과 문화, 코트 판 / 플라스크를 계대. 합류 인간 NPC 문화에서 미디어를 제거하고 PBS를 대기음 1X PBS로 한번 씻어. 모든 우물이 다음 37 ℃에서 5 분 동안 품어 커버하기에 충분한 세포 분리 솔루션을 추가합니다. 모든 세포가 분리했는지 확인하십시오. DMEM의 두 배를 추가 /F-12 웰 / 플라스크 세포 분리 용액과. 5 분 동안 200 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 DMEM / F-12 포함하는 셀을 전송합니다. 5 ml의 인간 NPC 유지 보수 매체 (표 1)에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 부드럽게 아래로 피펫 세포 현탁액을 위로하고 세포를 파괴합니다. 플레이트 마트 리겔 코팅 문화 우물 / 플라스크 및 최고 최대 10 μM Y-27632 보충 충분한 매체에 총 세포의 세 번째. 37 ° C와 5 % CO 2에서 배양 용기를 품어. 분할 문화 1 : 3을 모든 3-4일과 매일 매체 보충. 차별을 방지하기 위해 고밀도 인간 NPC 문화를 유지한다. 공동 문화에서 신경 세포로 인간의 NPC의 9 차별화 신경 세포로의 분화를 시작하기 전에 인간의 NPC 문화에 렌티 바이러스 벡터 Synapsin1-tdTomato를 추가합니다. 성상 세포 / 대뇌 피질의 신경 세포의 공동 문화를 준비인간의 NPC를 구별하기 전에 미리 일. 1X PBS로 한 번 인간의 NPC 문화를 세척하고 모든 우물을 커버하기에 충분한 세포 분리 솔루션을 추가 / 플라스크는 37 ℃에서 5 분 동안 품어. 모든 세포가 분리했는지 확인하십시오. 우물 / 플라스크에 세포 분리 솔루션의로 DMEM / F-12의 두 배를 추가합니다. 15 ML의 원심 분리기 튜브에 전송합니다. 5 분 동안 200 XG에 원심 분리기. 5 ml의 신경 세포 분화 배지 (표 1)에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 조심스럽게 피펫 세포 현탁액을 위 아래로 하나의 세포로 세포 펠렛을 깰. 단일 혈구 세포의 수를 계산. 조심스럽게 성상 세포 / 대뇌 피질의 신경 세포 문화 매체를 대기음. 5 × 103 세포 / cm 신경 분화 배지 (2) 500 μL의 24 웰 각각 10 μM Y-27632로 보충 (표 1) 및 인간의 NPC 접시. 조심스럽게 각 웰에 인간의 NPC를 포함하는 매체를 추가성상 세포와 대뇌 피질의 뉴런을 방해 방지 할 수 있습니다. 37 ° C와 5 % CO 2에서 번호판을 품어. 에서 최소 28 일 동안 새로운 배지로 모든 2~3일을 매체의 절반을 교체합니다. IPSC 파생 된 뉴런의 (10) 전기 생리 녹음 인간의 iPSCs 성숙한 신경 세포처럼 작동 여부를 확인합니다. 60X (0.9 NA) 침수 렌즈가 장착 된 수직 공 초점 현미경을 사용하여 tdTomato의 시각화에 의해 인간의 iPSCs에서 분화 된 세포를 찾아보십시오. 외부 용액을 실온에서 4 내지 6 M. 관류 셀의 저항 피펫 기록 당겨 (표 1)은 95 %, O2 / 5 % CO 2로 끊임없이 불어. 내부 솔루션 (표 1)과 함께 기록 마이크로 피펫을 채 웁니다. 똥개의 전류 주입 (1 초 시간, 10 pA로 증가)에 응답하여 전체 셀 모드와 기록 활동 전위 소성 패치 tdTomato + 셀클램프를 임대. ChR2을 표현하는 대뇌 피질 세포의 활동 전위가 안정적으로 빛 자극에 의​​해 유발되는 경우 확인합니다. 공 초점 현미경으로 GFP의 시각화에 의해 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 세포를 찾아보십시오. 단계 10.1.3에 10.1.2에 따라 대뇌 피질의 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행합니다. 확인 활동 전위가 안정적으로 수은 아크 램프 (100 W) 빛 조명에 의해 유발된다. 여기 필터의 파장의 40분의 480 ㎚이다. optogenetic 자극을 수행합니다. 패치 tdTomato + 전체 세포 모드 셀 -70mV에서 설정된 전압 클램프. 2 kHz에서 전류 신호를 필터 및 10 kHz에서 디지털화. (10)에서 녹음하는 동안 일관성을 위해 20 M에 이르기까지 일련의 저항을 모니터링합니다. 30 초 동안 100 W 수은 램프와 40분의 480 nm의 여기 필터에 의해 전체 필드를 자극한다. 기록 시냅스 전류의 photostimulation에 의해 유도 된 패치 셀의 (PSC를) 시냅스 코르 ChR2는 발현tical 뉴런. 검색 및 PSC를 측정한다. 각각 5 PA와 (20)를 PC에서 진폭 및 전류 영역에 대한 임계 값. 수동이 아닌 PSC 흔적을 폐기 이러한 이벤트를 검사합니다.