共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

注：すべての実験はSingHealthでの動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されている。 1.収穫出生後早期マウスの脳解剖前に、海馬組織消化液の準備：1ミリリットルあたり10μlのパパインを1Xアール平衡塩溶液（EBSS）（+ 1％HEPES）デオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI）（250 U / ml）及びディスパーゼII（1 U /とミリリットル）。組織消化溶液約2.5ミリリットルを加えて、0.20ミクロンフィルターユニットを使用してフィルタリングする。使用するまで37℃で温溶液にしてください。 5分間氷でそれらを置くことによって、生後5日（P5）マウスの仔を麻酔。つま先や尾のピンチを経由して、痛みの反射のために氷とテストから削除。 70％エタノールで子犬をスプレーします。子犬を斬首し、氷の上のペトリ皿に頭を置く。 小さなscissoのペアで、鼻への頭蓋底から、正中線に沿って皮膚に切開を作るRSまたは細かい解剖用鉗子。ピールは、肌を開き、頭蓋骨を通して類似の切開を作る。 、頭蓋骨の両側に2の追加の水平カットを作る（ブレグマで）1頭側と（ラムダで）1尾。 ピールは、基礎となる脳を露出させるために切開線に沿って頭蓋骨を開きます。嗅球の上にある頭蓋骨、およびそれらの間のすべての正中骨を除去するための一対の鉗子を使用してください。非解剖手にピンセットで安定した頭部を保持した状態でこれを行います。 脳の腹側部分と尾終わりに頭蓋底の間にへらの平坦部が容易になります。脳の下の頭蓋骨のベースにへらを平行に保ち、脳と頭蓋骨のベースとの間に癒着を切断するために頭蓋骨の頭側端に向けて移動する。 へらで脳をかき出すと、氷冷1X EBSS（+ 1％HEPES）を含むペトリ皿に入れてください。常時水没組織してください。 すべてのために顕微解剖工程、解剖顕微鏡下で作業し、それぞれの手で微細な解剖用鉗子を使用して、組織を切断するための一つであり、安定した組織を保持するための他の。 カットだけで後脳からそれを分離するために大脳皮質に後方を確認します。その2つの半球に大脳皮質を分離するために正中線に沿って切断。大脳半球から髄膜を削除します。 半球内側を上に配置し、海馬の下側脳室に鉗子を挿入します。中脳を切り取る。 海馬の上方および下方端部のカットを行い、歯状/嗅内皮質接合部付近皮質から海馬を隔離する。氷冷1X EBSS（+ 1％HEPES）を含む皿に海馬を収集します。 2.海馬組織解離予め温めておいた海馬組織消化溶液を含む皿に海馬を転送します。ミンチトン彼はできるだけ細かいに組織を海馬、37℃で30分間インキュベートする。 穏やかを15ml遠心管に機械的にピペッティングし、転送細胞によって単一の細胞に組織を解離する。 5分間200×gで遠心分離し、上清を除去します。 20ミリリットルに再懸濁細胞ペレットを10分間200×gで、ショ糖（0.9 M）と遠心分離器を含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）を0.5倍。 NPCの維持培地（ 表1）を2mlの上清を再懸濁細胞ペレットを除去する、5分間200×gで1×EBSS溶液および遠心機で、4％ウシ血清アルブミン（BSA）を10mlの上に置いた。 上清を除去し、細胞ペレットに、マウスのNPCの維持培地（ 表1）を追加します。静かに細胞ペレットを、単一細胞に分割されていることを確認するためにダウンして5〜10倍にアップするピペット。 プレコートされたマトリゲルプレートに細胞を含む培地に移し、上皮成長因子（EGF）およびfibroblaを追加ヘパリン番目の成長因子2（FGF2）（両方とも20ng / mlの）（5 mg / mlで）。 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする。 接着マウス海馬のNPCのeメンテナンスコー​​ティングされたプレート/フラスコ、少なくとも1時間は、マウスの海馬のNPCを継代する前に準備します。各プレートまたはフラスコの表面領域をカバーし、1時間室温でインキュベートするのに十分なマトリゲルを追加する。 90％のコンフルエントマウスNPC培養物からメディアを取り出して、1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で一回洗浄後、PBSをオフに吸引除去する。 全てのウェル/フラスコを覆い、37℃で5分間インキュベートするのに十分な細胞剥離液を加える。 すべての細胞は10倍の倍率で倒立明視野顕微鏡下で見ることによって切り離されていることを確認します。付着した細胞が残っている場合は、さらに1〜2分間の培養容器をインキュベートし、再び細胞を確認してください。ダルベッコ改変イーグル培地/ HamのF-12栄養混合物（DMEM / F-12）の二倍の量を追加します。一旦すべての細胞が剥離しているウェル/フラスコの細胞剥離液と同様である。 5分間200×gで15ミリリットルの遠心管と遠心分離機にDMEM / F-12含有細胞を転送します。 上清を除去し、マウスのNPC維持培地（ 表1）の5ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁します。静かに単一細胞に細胞ペレットを分割する上下にピペット。 EGFとFGF2で補充新しい培養ウェル/フラスコおよびトップアップ十分な培養培地への全​​細胞の第三のプレート。 37℃、5％CO 2で培養容器をインキュベートする。 3 3〜4日ごとに：メディアごとに二日と分割セル1を補充する。凝集及び剥離を防止するために、マウスNPC培養の異常増殖を避けてください。 星状細胞へのマウスのNPCの4分化アストロサイトへのマウスのNPCの分化を開始する前に、事前にポリ-L-リジン（PLL）/ラミニンコーティングされた12ミリメートルのカバーガラスに少なくとも一日を準備します。 COVを追加24ウェルプレートにerslips十分なPLL（ホウ酸緩衝液中1mg / ml）でのウェルの表面全体を覆​​う。 4℃で一晩プレートをインキュベート。次の日には、PLLを除去し、1×PBSで一回洗浄する。 その後、37℃で少なくとも4時間インキュベート、再び各ウェルの全表面領域を覆う、ラミニン（氷冷DMEM / F-12中1mg / ml）を加える。 マウスNPC培養物からメディアを取り出した後、PBSをオフに吸引し、1X PBSで一回洗浄します。 全てのウェル/フラスコを覆い、37℃で5分間インキュベートするのに十分な細胞剥離液を加える。 すべての細胞はその後切り離さDMEM / F-12ウェル/フラスコに細胞剥離液との二倍の量を追加したことを確認してください。 5分間200×gで15ミリリットルの遠心管と遠心分離機にDMEM / F-12含有細胞を転送します。 5ミリリットルアストロサイト分化培地（ 表1）で上清と再懸濁細胞を除去する。静かにピペット細胞suspensionの上下に単一細胞に細胞ペレットを分割する。血球計数器を持つ単一のセルの数を数える。 24ウェルプレートの各ウェルの培地を500μl中/ cm 2で5×10 4細胞で細胞をプレート。 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする。一日おきに新しい培地と培地の半分を交換してください。マウスNPCは急速に2日以内に、星状細胞に分化し、さらなる実験を開始する前の週のために区別されます。 5.収穫胚ラットの脳皮質組織解離星状細胞培養からアストロサイト分化培地（ 表1）を取り外し、主要ニューロン培地（ 表1）胚性ラット脳の収穫を開始する前に、少なくとも4時間で交換してください。 12.1 mg / mlのL-システインと1ミリリットル1X EBSS（+ 1％HEPES）あたり10μlのパパイン：解剖前に、皮質組織消化液を調製。約2を作る組織消化溶液0.5ミリリットルと0.20μmのフィルターユニットを使用してフィルタリングする。使用するまで37℃で温溶液にしてください。 圧縮ガスを使用して、二酸化炭素窒息によって妊娠ダムを安楽死させる。つま先や尾のピンチを経由して、痛みの反射のためのテスト。 吸収パッドに動物腹側を上に置き、70％エタノールとの腹部領域を浸す。腹部を露出させるために十分な幅、ピンセットで皮膚をつまみ、外科ハサミで横切開する。鉗子で腹膜をつかみ、腹腔を開きカット。 鉗子で子宮角を持ち上げ、子宮間膜に沿って自由にそれをカット。氷の上のペトリ皿に解剖子宮を置きます。それらの間の子宮組織を切断することにより、各胚を区切ります。 胚嚢切開を行います。静かに開口部を介して胎児を支払う。胎児を斬首し、氷の上のペトリ皿に頭を置く。 embryonを収穫するICのラットの脳には、ステップ1.3から1.5までの説明に従ってください。 皮質の組織を分析するために、脳半球の横側を上に配置します。途中から横方向に二つに半球をカット。近い脳のベースに半分を捨てる。中脳を除去するための切除した組織をトリミング。 予め温め皮質組織消化溶液を含む皿に皮質組織を転送します。可能な限り微細な皮質組織をみじん切りし、37℃で30分間インキュベートする。 予め温めておいた一次ニューロン培地（ 表1）を10 mlを含む50ml遠心管に組織消化溶液からの皮質組織を移す。無組織片と、均一な溶液が得られるまで、繰り返し、それらをピペッティング血清学的ピペットインによって皮質組織を解離。 残りの組織塊を除去するために70μmのセルストレーナーを通して組織液を渡します。 15ミリリットル中に組織液を分注し各チューブに約3ミリリットルを追加する遠心管、。 底部の上面およびBSA上の組織液で二層を形成し、各チューブの底に1×PBSにおける800μlの7.5％BSAを加える。 5分間200×gで遠心分離する。二つの層の界面からの吸引、上清を除去します。チューブの底に細胞ペレットを乱さないようにしてください。 1mlの一次ニューロン培地（ 表1）を各細胞ペレットを再懸濁し、15mlの遠心管にそれらを組み合わせる。血球計数器を用いて細胞密度を決定します。 一次皮質ニューロンの6エレクトロポレーションおよびメッキ注：遺伝子導入はエレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、およびウイルス形質導入を含むいくつかの方法を用いて達成することができる。このプロトコルでは、一次皮質ニューロンへの構築にChR2を提供するエレクトロポレーションについて説明します。 遠心機6×10 6ラット皮質ニューロンA5分間200×gでのトン、上清を除去します。少なくとも6×10 6皮質ニューロン生存ニューロンによって神経回路網の形成を確実にするために、エレクトロポレーションのために必要とされる。 静かに細胞ペレットを再懸濁にエレクトロポレーション溶液100μlを追加します。 pLenti-シナプシンhChR2の6μgの（H134R）-EYFP-WPRE 4プラスミドで細胞懸濁液100μlを組み合わせると認定されたキュベットに移す。転送中に気泡を生成する避ける。 選択して、製造業者の説明書に従ってエレクトロポレーションのための適切なプログラムを適用する。 エレクトロポレーション後、キュベットに細胞/ DNA懸濁液にMEMの500μlを添加する。 11.5ミリリットルに試料を移し、一次ニューロン培地（ 表1）、静かに懸濁します。メディアの合計量は、全24ウェルプレートのために十分である。アリコートを24ウェルプレートの各ウェルについての培地500μl。 37℃でプレートをインキュベートし、5％CO 2。 </OL> 人工多能性幹細胞の7世代注：このメソッドは、沖田らから適応されています10。 DMEM中で培養ヒト線維芽細胞を6ウェルプレートで、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した。 マトリゲルと線維芽細胞、コート6ウェルの再プログラミングを開始し、室温で少なくとも1時間インキュベートに先立ち。 80％のコンフルエンスで、線維芽細胞培養からメディアを削除し、1X PBSで一回洗浄します。 プレート全体をカバーし、10分間37℃でインキュベートし、十分な0.25％トリプシン-EDTAを加える。 細胞は、ウェルから除去した後、トリプシン消化をクエンチするトリプシンと10％のFBSを含むDMEMの倍の量を追加します。上下にそっとピペット細胞懸濁液の細胞を破壊する。血球計数器を持つ単一のセルの数を数える。 を15ml遠心管遠心5、200×gで細胞懸濁液に転送7×10 5細胞分。 上清を除去し、エレクトロポレーション溶液中で細胞ペレットを再懸濁します。製造元の指示に従って、線維芽細胞をエレクトロポ。エレクトロポレーション緩衝液100μlで細胞を再懸濁し、各ソームベクター1μgのを追加します。 1650 V、10ミリ秒と3時間パルスの設定でエレクトロポレーション細胞。 DMEM中に細胞懸濁液を移し、10％FBSを補充した6ウェルプレートのウェルあたり5×10 4細胞をプレー。 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする。 48時間後、トランスフェクトした線維芽細胞培養からメディアを削除し、mTeSR培地と交換してください。人工多能性幹細胞（IPSC）コロニーを単離することの準備ができるまで、毎日培養培地を交換してください。 IPSCコロニーを28-35日後に観察することができる。 ときに分離のための準備ができて、機械的にIPSCコロニーをカットし、マトリゲル被覆した6ウェルプレート12上に10μMのRho関連タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤（Y-27632）でmTeSR媒体に再シード。毎日の培養液を交換してください。 8.神経誘導と人間のNPCのメンテナンス注：この方法は、Li らによって記載されている11 IPSC培養が20％コンフルエンスのまわりにあるとき、mTeSR培地を除去し、神経誘導培地（ 表1）に置き換える。一日おきに培地を補充する。 7日後、神経誘導培地を除去し、人間のNPCの維持培地（ 表1）に置き換える。文化を継代7日前一日おき​​に培地をアップ補給。 以前は、少なくとも時間室温でマトリゲルと文化、コートプレート/フラスコを継代。 コンフルエント人間NPC培養物からメディアを取り出した後、PBSをオフに吸引し、1X PBSで一回洗浄します。 37℃で5分間インキュベートし、その後すべてのウェルをカバーするために十分な細胞剥離溶液を添加する。 すべての細胞が剥離したことを確認してください。 DMEMの倍の量を追加/F-12ウェル/フラスコの細胞剥離液と同様である。 5分間200×gで15ミリリットルの遠心管と遠心分離機にDMEM / F-12含有細胞を転送します。 5mlの上清の再懸濁細胞を除去し、ヒトNPC維持培地（ 表1）。上下にそっとピペット細胞懸濁液の細胞を破壊する。 プレートマトリゲル被覆された培養ウェル/フラスコおよびトップアップ10μMのY-27632を補足した十分な媒体への全細胞の第三。 37℃、5％CO 2で培養容器をインキュベートする。 スプリット培養1：3、3〜4日毎と一日おきに培地を補充する。分化を防止するために、高密度に人間のNPC培養を維持します。 共培養におけるニューロンへの人間のNPCの9分化神経細胞への分化を開始する前に、人間のNPC培養物へのレンチウイルスベクターシナプシン-tdTomatoを追加します。アストロサイト/皮質ニューロン共培養を準備人間のNPCを区別する前に予め日。 1×PBSで一回ヒトNPC培養物を洗浄し、全てのウェルをカバーするために十分な細胞剥離液を追加/次いで、フラスコを37℃で5分間インキュベートする。 すべての細胞が剥離したことを確認してください。ウェル/フラスコに細胞剥離液のそれとDMEM / F-12の倍の量を追加します。 15ミリリットル遠心管に移す。 5分間200×gで遠心分離する。 5mlの上清の再懸濁細胞を除去し、神経分化培地（ 表1）。穏やかにピペット細胞懸濁液上下単一細胞に細胞ペレットを破壊する。血球計数器を持つ単一のセルの数を数える。 慎重にアストロサイト/皮質ニューロン培養物からの培地を吸引除去する。各24ウェルのために10μMのY-27632を補足した神経細胞の分化培地（ 表1）の500μlの5×10 3細胞/ cm 2でプレート人間のNPC。静かに各ウェル中に人間のNPCを含む培地を追加星状細胞および皮質ニューロンを乱さないよう。 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする。少なくとも28日間、2〜3日ごとに新鮮な培地に培地の半分を交換してください。 IPSC由来のニューロンの10。電気生理学的記録人間性IPSCは、成熟ニューロンのように動作するかどうか確認してください。 60X（0.9 NA）水浸レンズを搭載した直立共焦点顕微鏡を用いてtdTomatoの可視化により、ヒトiPS細胞から分化した細胞を探す。 外液（ 表1）中、室温で4~6 M.潅流細胞の耐性への記録ピペットを引く、95％O 2/5％CO 2で常に泡立て。内部溶液（ 表1）で記録マイクロピペットを埋める。 curの電流注入（1秒の期間、10 pAの増分）に応答して、ホールセルモードと記録活動電位発火パッチtdTomato +細胞クランプを借りる。 ChR2をを表現する皮質細胞の活動電位を確実に光刺激によって誘発されている場合を確認してください。 皮質細胞は、共焦点顕微鏡下でGFPの可視化によってChR2をを表現して下さい。 、手順10.1.3に10.1.2に従うことによって皮質細胞上の全細胞パッチクランプ記録を行う。 チェック活動電位を確実に水銀アークランプ（100W）で光照射によって誘発される。励起フィルターの波長は40分の480の程度である。 光遺伝学的刺激を実行します。 ホールセルモード及び-70mVにおける設定電圧クランプパッチtdTomato +細胞。 2 kHzで電流信号をフィルタリングし、10kHzでデジタル化する。録音中に一貫性のために、10〜20 Mまでの直列抵抗を監視します。 30秒間、100Wの水銀ランプで40分の480 nmの励起フィルターによるフィールド全体を刺激する。 ChR2を発現シナプス前CORの光刺激によって誘発されるパッチを適用したセルの録音シナプス後電流（のPSC）ticalニューロン。のPSCを検出し、測定する。それぞれ5 Paと20 PC、での振幅と電流エリアに設定されたしきい値。手動で任意の非PSCトレースを破棄するようにこれらのイベントを検査します。