Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

HINWEIS: Alle Experimente werden durchgeführt, folgende Protokolle von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee Singhealth zugelassen. 1. Erntefrühpostnatale Mäuse Brains Vor der Präparation, bereiten Sie die Hippocampus-Gewebe Aufschlusslösung: 10 & mgr; Papain pro 1 ml 1x Earles Balanced Salt Solution (EBSS) (+ 1% HEPES) mit Deoxyribonuclease I (DNase I) (250 U / ml) und Dispase II (1 U / ml). Stellen Sie ca. 2,5 ml der Gewebeaufschlusslösung und filtern es mit einem 0,20 um-Filtereinheit. Warmhalten der Lösung bei 37 ° C bis zur Verwendung. Anesthetize die postnatalen Tag 5 (P5) Mäuse Welpen, indem sie in Eis für 5 min. Von Eis und Test entfernen Schmerzreflex über Zehe oder Schwanz kneifen. Sprühen Sie die Welpen mit 70% Ethanol. Enthaupten die Welpen und legen die Köpfe in einer Petrischale auf Eis. Einen Einschnitt in der Haut entlang der Mittellinie von der Basis des Schädels an der Nase, mit einem Paar von kleinen scissors oder feine Dissektionszangen. Reißen Sie die Haut und machen einen ähnlichen Schnitt durch den Schädel. Machen zwei zusätzliche horizontale Schnitte auf jeder Seite des Schädels eines rostral (am Bregma) und eine kaudale (am lambda). Reißen Sie den Schädel entlang der Ritzlinien, die zugrunde liegende Gehirn aus. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schädel, die über den Riechkolben, und jede Mittellinie Knochen zwischen ihnen zu entfernen. Tun Sie dies, wenn Sie den Kopf mit einer Pinzette in der nicht-Sezieren Hand stabil halten. Erleichtern den flachen Teil einer Spachtel zwischen dem ventralen Teil des Gehirns und der Schädelbasis am Schwanzende. Halten Sie den Spachtel parallel zur Basis des Schädels unter dem Gehirn, bewegen Sie ihn in Richtung des rostralen Ende des Schädels, alle Verwachsungen zwischen dem Gehirn und der Basis des Schädels durchtrennen. Scoop das Gehirn mit dem Spachtel und legen Sie sie in eine Petrischale mit eiskaltem 1x EBSS (+ 1% HEPES). Zellgewebe zu jeder Zeit unter Wasser. Für alleMikrodissektion Schritte, Arbeit unter einem Binokular und verwenden Sie ein Paar feine Dissektionszangen in jeder Hand, eine zum Schneiden von Gewebe, und die andere zum Halten der Gewebe stabil. Machen Sie einen Schnitt nur posterior zur Großhirnrinde, um sie vom Hinterhirn zu trennen. Entlang der Mittellinie geschnitten, um die Hirnrinde in seine beiden Halbkugeln zu trennen. Entfernen Sie die Hirnhäute aus den Gehirnhälften. Legen Sie eine Hemisphäre medialen Seite nach oben und setzen Sie die Pinzette in den lateralen Ventrikel unterhalb des Hippocampus. Schneiden Sie den Mittelhirn. Stellen Schnitte an den oberen und unteren Enden des Hippocampus und in der Nähe des Gyrus / entorhinalen Kortex Kreuzung, um den Hippocampus von der Rinde zu isolieren. Sammeln Sie die hippocampi in eine Schale mit eiskaltem 1x EBSS (+ 1% HEPES). 2. Hippocampus Gewebedissoziation Übertragen Sie die hippocampi, um ein Gericht, das die vorgewärmten hippokampalen Gewebeaufschlusslösung. Mince ter Hippocampus-Gewebe so fein wie möglich und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Sanft dissoziieren Gewebe in einzelne Zellen durch mechanische Pipettieren und Übertragungszellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 200 xg für 5 min und Überstand. Resuspendieren Zellpellet in 20 ml 0,5X ausgeglichener Hank-Salzlösung (HBSS) Saccharose (0.9 M) und Zentrifuge enthält bei 200 × g für 10 min. Entfernen des Überstandes und Resuspension Zellpellet in 2 ml NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1), auf die Oberseite von 10 ml von 4% Rinderserumalbumin (BSA) in 1X EBSS-Lösung und Zentrifuge 5 min bei 200 xg platziert. Überstand entfernen und fügen Maus NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1) zum Zellpellet. Gently Pipette auf und ab 5-10 mal, um sicherzustellen, Zellpellet wird in Einzelzellen zerlegt. Übertragungsmedium enthaltenden Zellen in vorbeschichteten Matrigel Platten und fügen den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und fibroblast-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) (beide 20 ng / ml) in Heparin (5 mg / ml). Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2. 3. Wartung von adhärenten Maus Hippocampus NPCs Bereiten Sie die beschichteten Platten / Kolben mindestens eine Stunde vor der Passage der Maus Hippocampus NPCs. Fügen Sie genug Matrigel, die Oberfläche jeder Platte oder Kolben abdecken und bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Entfernen Sie das Medium aus 90% konfluent Maus NPC Kulturen und sofort abwaschen mit 1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), dann absaugen PBS ab. Fügen Sie genug Zellablösung Lösung in jede Vertiefung / Flaschen bedecken und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen, indem du unter einem inversen Hellfeld-Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung abgelöst. Wenn es noch Zellen angebracht, Inkubation Kulturgefäß für eine weitere 1-2 min und prüfen Zellen wieder. Ist die doppelte Menge von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium / Ham-F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F-12)wie die der Zellentfernungslösung in die Vertiefungen / Kolben einmal alle Zellen abgelöst. Übertragen DMEM / F-12 enthaltenden Zellen in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in 5 ml Maus NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1). Gently Pipette auf und ab, um in einzelne Zellen aufzubrechen Zellpellet. Platte ein Drittel der gesamten Zellen in neue Kulturschalen / Kolben und füllen Sie ausreichend Kulturmedium mit EGF und FGF2 ergänzt. Kulturgefäßen bei 37 ° C und 5% CO 2. Tanken Medium jeden zweiten Tag und geteilte Zellen 1: 3 alle 3 bis 4 Tage. Vermeiden Sie übermäßiges Wachstum von Maus NPC Kulturen, um die Aggregation und Ablösung zu verhindern. 4. Differenzierung von Maus-NPCs in Astrozyten Bereiten Poly-L-Lysin (PLL) / Laminin 12 mm Deckgläser mindestens einen Tag im Voraus vor Beginn der Differenzierung von Maus-NPCs in Astrozyten. Cov hinzufügenerslips in eine 24-Well-Platte und Deckel gesamten Oberflächenbereich der Vertiefungen mit genügend PLL (1 mg / ml in Boratpuffer). Inkubieren der Platte über Nacht bei 4 ° C. Am folgenden Tag, entfernen PLL und einmal mit 1x PBS waschen. Hinzufügen Laminin (1 mg / ml in eiskaltem DMEM / F-12), wiederum über die gesamte Oberfläche von jeder Vertiefung, dann Inkubieren für mindestens 4 Stunden bei 37 ° C. Entfernen Sie das Medium aus der Maus NPC Kulturen und sofort abwaschen mit 1x PBS dann absaugen PBS ab. Fügen Sie genug Zellablösung Lösung in jede Vertiefung / Flaschen bedecken und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Sicherzustellen, dass alle Zellen abgeplatzt ist die doppelte Menge an DMEM / F-12 als derjenigen der Zellentfernungslösung in die Vertiefungen / Kolben. Übertragen DMEM / F-12 enthaltenden Zellen in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und Zellen in 5 ml Astrozyten Differenzierungsmedium (Tabelle 1). Gently Pipette Zell suspension nach oben und unten, um in einzelne Zellen aufzubrechen Zellpellet. Die Anzahl der einzelnen Zellen mit einer Zählkammer. Platten Zellen bei 5 × 10 4 Zellen / cm 2 in 500 ul Medium pro Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums mit frischem Medium jeden zweiten Tag. Maus NPCs schnell in Astrozyten in 2 Tagen zu unterscheiden und sind für eine Woche vor Beginn der weiteren Experimenten unterschieden. 5. Ernte embryonalen Rattenhirnen und Rindengewebe Dissoziation Entfernen Astrozyten Differenzierungsmedium (Tabelle 1) von Astrozytenkulturen und ersetzen mit primären Neuronen Medium (Tabelle 1) mindestens 4 Stunden vor Beginn der Ernte der embryonalen Rattenhirnen. Vor der Präparation, bereiten Sie die Rindengewebe Aufschlusslösung: 10 & mgr; mit 12,1 mg / ml L-Cystein Papain pro 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES). Stellen Sie ungefähr 20,5 ml der Gewebeaufschlusslösung und filtern es mit einem 0,20 um-Filtereinheit. Warmhalten der Lösung bei 37 ° C bis zur Verwendung. Euthanize die schwangere Mutter von Erstickung mit Kohlendioxid mit Hilfe von Druckgas. Test für Schmerzreflex über Zehe oder Schwanz kneifen. Legen Sie das Tier Bauchseite nach oben auf ein absorbierendes Kissen und genießen ihren Bauchbereich mit 70% Ethanol. Klemmen Sie die Haut mit einer Pinzette und eine laterale Inzision mit einem Paar von chirurgische Scheren, breit genug, um den Bauch aus. Fassen Sie das Bauchfell mit der Pinzette und schneiden Sie die Bauchhöhle. Heben Sie das Uterushorn mit der Pinzette und schneiden Sie es kostenlos an der Mesometrium. Legen Sie die seziert Gebärmutter in einer Petrischale auf Eis. Trennen Sie die einzelnen Embryos, indem das Gebärmuttergewebe zwischen ihnen. Einen Einschnitt in der Fruchtblase. Schale vorsichtig den Fötus durch die Öffnung. Enthaupten den Fötus und legen den Kopf in einer Petrischale auf Eis. Um embryon erntenic Rattenhirnen, folgen Sie der Beschreibung der Schritte 1.3 bis 1.5. Um kortikalen Gewebe zu sezieren, legen Sie eine Gehirnhälfte lateralen Seite nach oben. Schneiden Sie die Halbkugel in zwei seitlich von der Mitte. Entsorgen der Hälfte näher an der Basis des Gehirns. Schneiden Sie das Gewebe herausgeschnitten, um das Mittelhirn zu entfernen. Übertragen Sie die kortikalen Gewebe, um ein Gericht, das die vorgewärmten Rindengewebe Aufschlusslösung. Blatt vor den kortikalen Gewebe so fein wie möglich und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Übertragen der kortikalen Gewebe aus der Gewebeverdauungslösung in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml vorgewärmten primären Neuron-Medium (Tabelle 1). Distanzieren die kortikale Gewebe durch wiederholtes Pipettieren sie nach oben und unten in einer serologischen Pipette, bis eine homogene Lösung ohne Gewebestücke erhalten wird. Übergeben Sie die Gewebe Lösung durch ein 70 um Zellsieb um verbleibende Gewebe Klumpen herausfiltern. Aliquot der Gewebelösung in 15 mlZentrifugenröhrchen, indem etwa 3 ml in jedes Röhrchen. Zugabe von 800 & mgr; l 7,5% BSA in 1 × PBS auf den Boden jeder Röhre, welche zwei Schichten mit dem Gewebe-Lösung auf die Oberseite und BSA an der Unterseite. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Entfernen des Überstandes, Ansaugen von der Schnittstelle der zwei Schichten. Vermeiden das Zellpellet am Boden des Röhrchens zu stören. Resuspendieren Zellpellets in 1 ml primäre Neuron-Medium (Tabelle 1), und sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einer Zählkammer. 6. Die Elektroporation und Oberflächen der Primär kortikalen Neuronen HINWEIS: Gentransfer kann mit verschiedenen Verfahren, einschließlich Elektroporation, Calciumphosphat-Transfektion und viralen Transduktion erzielen. In diesem Protokoll beschreiben wir Elektroporation zu liefern ChR2 Konstrukts in primären kortikalen Neuronen. Zentrifuge 6 x 10 6 kortikale Neuronen der Ratte at 200 xg für 5 min und Überstand. Mindestens 6 x 10 6 kortikalen Neuronen für die Elektroporation benötigt, um die Bildung eines neuronalen Netzwerks von überlebenden Neuronen gewährleisten. 100 l Elektroporation Lösung Pellet resuspendieren Zell und sanft. Kombinieren Sie 100 ul der Zellsuspension mit 6 ug pLenti-Synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 Plasmid und Transfer in einem zertifizierten Küvetten. Vermeiden Herstellung von Luftblasen während der Übertragung. Auswahl und Anwendung der entsprechenden Programm für die Elektroporation gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der Elektroporation, fügen Sie 500 ul MEM zu Zell / DNA-Suspension in die Küvette. Übertragen Sie die Probe in 11,5 ml primären Neuron Medium (Tabelle 1) und resuspendieren sanft. Die Gesamtmenge der Medien für eine ganze Platte mit 24 Vertiefungen ausreichend. Aliquot 500 ul Medium zu jedem Well einer 24-Well-Platte. Inkubieren Platte bei 37 ° C und 5% CO 2. </ol> 7. Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen . HINWEIS: Diese Methode wurde von Okita et al angepasst 10 Kultur humaner Fibroblasten in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in 6-Well-Platten. Vor Beginn der Reprogrammierung von Fibroblasten, Mantel 6-Vertiefungen, die mit Matrigel und Inkubation für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur. Bei 80% Konfluenz, entfernen Medien aus Fibroblastenkulturen und einmal mit 1x PBS waschen. Füge hinreichend 0,25% Trypsin-EDTA, ganze Platte abdecken und bei 37 ° C für 10 min. Sobald Zellen wurden aus den Vertiefungen verdrängt, ist die doppelte Menge von DMEM mit 10% FBS wie die Trypsin Trypsinverdau quenchen. Gently Pipette Zellsuspension nach oben und unten zu brechen Zellen. Die Anzahl der einzelnen Zellen mit einer Zählkammer. Übertragungs 7 x 10 5 Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere die Zellsuspension bei 200 xg für 5Minute Überstand entfernen und Zellpellet resuspendieren in Elektroporation Lösung. Elektroporieren die Fibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zellen in 100 ul Elektroporationspuffer und mit 1 ug jedes episomalen Vektor. Elektroporieren Zellen mit Einstellungen von 1.650 V, 10 ms und 3 Zeitimpulse. Transferzellsuspension in DMEM, ergänzt mit 10% FBS und die Platte 5 x 10 4 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte. Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2. Nach 48 Stunden, entfernen Medien von transfizierten Fibroblastenkulturen und ersetzen mTeSR Medium. Ersetzen Kulturmedien täglich bis induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Kolonien sind bereit, isoliert werden. Nach 28 bis 35 Tagen können iPSC Kolonien beobachtet werden. Wenn Sie bereit sind für die Isolierung, mechanisch geschnitten eine iPSC Kolonie und ein erneutes Seeding in mTeSR Medium mit 10 & mgr; Rho-associated protein kinase (ROCK) Inhibitor (Y-27632) auf eine Matrigel beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen 12. Ersetzen Kulturmedium täglich. 8. Neural Einleitung und Aufrechterhaltung von Menschen NPCs . HINWEIS: Diese Methode wurde von Li et al 11 Wenn iPSC Kulturen sind etwa 20% Konfluenz entfernen mTeSR Medium und tauschen Sie mit neuronalen Induktionsmedium (Tabelle 1). Tanken an jedem zweiten Tag Medium. Nach 7 Tagen entfernen neuronalen Induktionsmedium und ersetzen menschliches NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1). Tanken Medium jeden zweiten Tag bis zu 7 Tage vor Passage Kulturen. Vor der Passage Kulturen, Mantel Platten / Kolben mit Matrigel bei Raumtemperatur für mindestens eine Stunde. Entfernen Sie das Medium von konfluenten menschlichen NPC Kulturen und einmal abwaschen mit 1x PBS dann absaugen PBS ab. Fügen Sie genug Zellablösung Lösung decken alle Vertiefungen dann Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen abgelöst. Ist die doppelte Menge an DMEM /F-12 als derjenigen der Zellentfernungslösung in die Vertiefungen / Kolben. Übertragen DMEM / F-12 enthaltenden Zellen in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und Zellen in 5 ml Human NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1). Gently Pipette Zellsuspension nach oben und unten zu brechen Zellen. Platte ein Drittel der gesamten Zellen in Matrigel beschichteten Kultur Wells / Kolben und füllen Sie ausreichend Medium mit 10 & mgr; Y-27632 ergänzt. Kulturgefäßen bei 37 ° C und 5% CO 2. Split Kulturen 1: 3 alle 3 bis 4 Tage und füllt jeden zweiten Tag Medium. Pflegen menschlichen NPC Kulturen mit hoher Dichte, die Differenzierung zu verhindern. 9. Differenzierung humaner NPCs in Neuronen in Co-Kulturen Fügen Sie den lentiviralen Vektor-Synapsin1 tdTomato die menschliche NPC Kultur vor der Einleitung der Differenzierung in Neuronen. Bereiten Astrozyten / kortikalen Neuronen Co-Kultureneinen Tag im Voraus vor der differenzierenden humanen NPCs. Menschen NPC Kulturen einmal abwaschen mit 1x PBS und fügen Sie genug Zellablösung Lösung in jede Vertiefung bedecken / Kolben dann Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen abgelöst. Ist die doppelte Menge von DMEM / F-12 als derjenigen der Zellentfernungslösung in die Vertiefungen / Kolben. In einen 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und Zellen in 5 ml neuronalen Differenzierungsmedium (Tabelle 1). Gently Pipette Zellsuspension auf und ab, um in einzelne Zellen aufzubrechen Zellpellet. Die Anzahl der einzelnen Zellen mit einer Zählkammer. Sorgfältig absaugen Medium von Astrozyten / Kulturen von kortikalen Neuronen. Platte menschlichen Charaktere bei 5 x 10 3 Zellen / cm 2 in 500 ul neuronalen Differenzierungsmedium (Tabelle 1) mit 10 & mgr; M Y-27632 für jede 24-Well ergänzt. Medium mit menschlichen NPCs hinzufügen vorsichtig in jedes Wellum zu vermeiden, die Astrozyten und kortikalen Neuronen stören. Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums mit frischem Medium alle zwei bis drei Tage für mindestens 28 Tage. 10. Elektrophysiologische Aufnahmen von iPS-abgeleiteten Neuronen Überprüfen Sie, ob die menschliche iPS-Zellen verhalten sich wie reife Nervenzellen. Suche Zellen aus menschlichen iPS-Zellen durch Visualisierung tdTomato differenziert mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop mit einem 60x (0,9 NA) Eintauchen in Wasser-Objektiv ausgestattet. Ziehen Aufzeichnungspipette auf einen Widerstand von 4 bis 6 M. perfundieren Zellen bei Raumtemperatur in einer externen Lösung (Tabelle 1) eingeblasen ständig mit 95% O 2/5% CO 2. Füllen Sie den Aufnahme-Mikropipette mit internen Lösung (Tabelle 1). Patch tdTomato + Zelle in Ganzzellmodus und Aufnahme neuronaler Aktivität als Reaktion auf Stromeinspeisung (1 sec Dauer, 10 pA-Schritten) in curmieten Klemme. Bestätigen Sie, ob Aktionspotential der kortikalen Zellen, ChR2 zuverlässig durch Lichtstimulation hervorgerufen. Suche kortikalen Zellen, ChR2 durch Visualisierung von GFP unter einem konfokalen Mikroskop. Führen Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf kortikalen Zellen durch folgende Schritte 10.1.2 bis 10.1.3. Aktion Überprüfen Potenzial zuverlässig durch Lichtbeleuchtung mit Quecksilberdampflampe (100 W) hervorgerufen. Die Wellenlänge der Anregungsfilter 480/40 nm. Führen optogenetische Stimulation. Patch tdTomato + Zelle in Ganzzell-Modus und stellen Spannungsklemme an -70mV. Filter Stromsignale bei 2 kHz und bei 10 kHz zu digitalisieren. Monitor-Serienwiderstände im Bereich von 10 bis 20 M auf Konsistenz während Aufnahmen. Stimulieren ganze Feld von 100 W-Quecksilberlampe mit 480/40 nm Anregungsfilter 30 Sek. Nehmen postsynaptischen Ströme (PSCs) der gepatchten Zelle durch Foto induzierter ChR2-exprimierenden präsynaptischen corschen Neuronen. Erkennen und messen PSCs. Stellen Schwelle für Amplitude und Ströme Bereich bei 5 pA und 20 pC auf. Manuell überprüfen diese Ereignisse, um alle nicht PSC Spuren zu verwerfen.