Une approche pour l'évaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture

REMARQUE: Toutes les expériences sont réalisées protocoles approuvés par le soin et l'utilisation des animaux au Comité institutionnel SingHealth suivantes. 1. Brains récolte postnatale précoce souris Avant de dissection, de préparer la solution de digestion de tissu hippocampique: 10 ul de la papaïne par solution saline équilibrée de 1 ml 1x Earle (EBSS) (+ 1% de HEPES) avec la désoxyribonucléase I (DNase I) (250 U / ml) et de dispase II (1 U / ml). Ajouter environ 2,5 ml de la solution de digestion de tissu et un filtrage à l'aide d'une unité de filtre de 0,20 um. Conserver la solution chaude à 37 ° C jusqu'à utilisation. Anesthésier les postnatales jour 5 (P5) bébés souris en les mettant dans la glace pendant 5 min. Retirer de la glace et de test pour réflexe de la douleur via orteil ou pincement de la queue. Vaporiser les chiots avec 70% d'éthanol. Décapiter les chiots et placer les têtes dans une boîte de Pétri sur de la glace. Faire une incision dans la peau le long de la ligne médiane à partir de la base du crâne pour le nez, d'une paire de petits Ciseauxrs ou pince fine de dissection. Peel ouvrir la peau et faire une incision similaires à travers le crâne. Faites deux coupes horizontales supplémentaires de chaque côté du crâne, une rostrales (au bregma) et une caudale (au lambda). Peel ouvrir le crâne le long des lignes incisées pour exposer le cerveau sous-jacent. Utilisez une pince pour enlever le crâne recouvrant les bulbes olfactifs, et un os de la ligne médiane entre eux. Pour ce faire, tout en maintenant la tête stable avec une paire de pinces à la main non-dissection. Facilité la partie plate d'une spatule entre la partie ventrale du cerveau et de la base du crâne à l'extrémité caudale. Garder la spatule parallèle à la base du crâne sous le cerveau, le déplacer vers l'extrémité rostrale du crâne de rompre toutes les adhérences entre le cerveau et la base du crâne. Scoop le cerveau avec la spatule et le placer dans une boîte de Pétri contenant de la glace-froid 1x EBSS (+ 1% HEPES). Gardez tissus submergées en tout temps. Pour tousétapes de microdissection, le travail sous un microscope de dissection et d'utiliser une paire de pince fine de dissection dans chaque main, un pour couper le tissu, et l'autre pour maintenir le tissu stable. Faites une entaille juste en arrière vers le cortex cérébral de la séparer de le cerveau postérieur. Coupez le long de la ligne médiane pour séparer le cortex cérébral dans ses deux hémisphères. Retirez les méninges des hémisphères cérébraux. Placez un hémisphère côté médial et insérer la pince dans le ventricule latéral sous l'hippocampe. Coupez le mésencéphale. Faire des coupes au niveau des extrémités supérieure et inférieure de l'hippocampe, et à proximité du dentate / cortex entorhinal jonction pour isoler l'hippocampe du cortex. Recueillir l'hippocampe dans un plat contenant de la glace-froid 1x EBSS (+ 1% HEPES). 2. hippocampe dissociation tissulaire Transférer la hippocampes dans un plat contenant la solution de digestion de tissu hippocampique préchauffé. Mince til hippocampe tissus de la plus fine possible et incuber pendant 30 min à 37 ° C. Dissocier doucement tissus dans des cellules individuelles par des cellules de pipetage et de transfert mécaniques dans un tube de 15 ml centrifugeuse. Centrifuger à 200 g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire dans 20 ml égal à 0,5 fois la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant du saccharose (0,9 M) et centrifuger à 200 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans la cellule 2 ml de milieu d'entretien NPC (tableau 1), placé au-dessus de 10 ml de 4% de sérumalbumine bovine (BSA) dans une solution EBSS 1X et centrifuger à 200 g pendant 5 min. Retirer le surnageant et ajouter un milieu d'entretien de NPC de souris (tableau 1) au culot cellulaire. Pipette doucement monter et descendre 5-10 fois pour assurer culot cellulaire est divisé en cellules individuelles. Transférer les cellules contenant moyennes dans des plaques de Matrigel pré-enduits et ajouter le facteur de croissance épidermique (EGF) et fibroblae le facteur de croissance 2 (FGF2) (tous deux 20 ng / ml) dans de l'héparine (5 mg / ml). Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2. 3. Maintien des adhérentes souris hippocampe PNJ Préparer les plaques revêtues / flacons au moins une heure avant PNJ hippocampe passages de souris. Ajouter suffisamment Matrigel pour couvrir la surface de chaque plaque ou flacon et incuber à température ambiante pendant 1 h. Retirez le support de 90% des cultures de NPC confluence de souris et laver une fois avec 1x tampon phosphate salin (PBS), puis aspirer hors PBS. Ajouter suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits / flacons et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Veiller à ce que toutes les cellules ont détaché en regardant sous un champ microscope optique inversé au grossissement 10X. Se il ya encore des cellules fixées, incuber récipient de culture pour une nouvelle 1-2 min et vérifier à nouveau les cellules. Ajouter deux fois la quantité de modification F-12 Eagle éléments nutritifs Mélange moyen / Ham de Dulbecco (DMEM / F-12)que celle de la solution de détachement cellulaire dans les puits / une fois toutes les cellules des flacons ont détaché. Transfert du DMEM / F-12 contenant les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger 15 ml à 200 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant et culot de cellules de remettre en suspension dans 5 ml de milieu d'entretien de NPC de souris (tableau 1). Pipette doucement monter et descendre pour briser culot cellulaire en cellules individuelles. Plate tiers du nombre total de cellules en culture de nouveaux puits / flacons et l'appoint de milieu de culture suffisante complétées avec de l'EGF et FGF2. Incuber des récipients de culture à 37 ° C et 5% de CO 2. Reconstituer moyenne tous les deux jours et diviser des cellules 1: 3 tous les 3 à 4 jours. Éviter la prolifération des cultures de l'APN de la souris pour empêcher l'agrégation et le détachement. 4. Différenciation des souris PNJ en astrocytes Préparer poly-L-lysine (PLL) / laminine enduit 12 mm couverture verres au moins un jour à l'avance avant de lancer la différenciation des PNJ de souris en astrocytes. Ajouter coverslips dans une plaque à 24 puits et couvre toute la surface du puits avec suffisamment PLL (1 mg / ml dans du tampon borate). Incuber la plaque pendant une nuit à 4 ° C. Le lendemain, retirez PLL et laver une fois avec PBS 1x. Ajouter laminine (1 mg / ml dans de la glace froide DMEM / F-12), couvrant à nouveau l'ensemble de la surface de chaque puits, puis incuber pendant au moins 4 heures à 37 ° C. Retirez le support à partir de cultures de NPC de souris et laver une fois avec 1x PBS, puis aspirer hors PBS. Ajouter suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits / flacons et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Veiller à ce que toutes les cellules ont détaché puis ajoutez deux fois la quantité de DMEM / F-12 comme celle de la solution de détachement cellulaire aux puits / flacons. Transfert du DMEM / F-12 contenant les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger 15 ml à 200 xg pendant 5 min. Éliminer les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu de différenciation des astrocytes (tableau 1). Doucement suspensio cellulaire de pipetten haut et bas pour briser culot cellulaire en cellules individuelles. Comptez le nombre de cellules individuelles avec un hémocytomètre. des cellules de germes à 5 x 10 4 cellules / cm 2 dans 500 ul de milieu de chaque puits d'une plaque à 24 puits. Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2. Remplacer la moitié du milieu par du milieu frais tous les deux jours. Souris PNJ différencier rapidement dans les astrocytes dans les 2 jours et sont différenciés pour une semaine avant de commencer de nouvelles expériences. 5. Brains récolte embryonnaire Rat et de dissociation de tissu cortical Retirer milieu de différenciation des astrocytes (tableau 1) à partir de cultures d'astrocytes et de remplacer par du milieu primaire de neurones (tableau 1) au moins 4 h avant le début de la récolte de cerveaux de rats embryonnaires. Avant de dissection, de préparer la solution de digestion de tissu cortical: 10 ul papaïne par 1 ml 1x EBSS (+ 1% de HEPES) à 12,1 mg / ml de L-cystéine. Faire environ 20,5 ml de la solution de digestion de tissu et un filtrage à l'aide d'une unité de filtre de 0,20 um. Conserver la solution chaude à 37 ° C jusqu'à utilisation. Euthanasier le barrage enceinte par asphyxie au dioxyde de carbone à l'aide de gaz comprimé. Test de réflexe de la douleur via orteil ou pincement de la queue. Poser le côté ventral animaux sur un tampon absorbant et laisser tremper sa zone abdominale avec 70% d'éthanol. Pincer la peau avec une paire de pinces et de faire une incision latérale d'une paire de ciseaux chirurgicaux, suffisamment large pour exposer l'abdomen. Saisissez le péritoine avec les pinces et couper ouvrir la cavité abdominale. Soulevez la corne utérine avec les pinces et couper gratuitement le long de la mésomètre. Placez l'utérus disséqué dans une boîte de Pétri sur de la glace. Séparer chaque embryon en coupant le tissu utérin entre eux. Faire une incision dans le sac embryonnaire. Shell doucement le fœtus à travers l'ouverture. Décapiter le fœtus et placer la tête dans une boîte de Pétri sur de la glace. Pour récolter embryoncerveaux de rats ic, suivent la description des étapes 1.3 à 1.5. Afin de disséquer les tissus corticaux, placez côté latéral jusqu'à un cerveau. Couper l'hémisphère en deux latéralement à partir du milieu. Jeter la moitié proche de la base du cerveau. Coupez le tissu excisé pour enlever le mésencéphale. Transférer les tissus corticaux dans un plat contenant la solution de digestion de tissu cortical préchauffé. Émincer les tissus corticaux à la plus fine possible et incuber pendant 30 min à 37 ° C. Transférer les tissus corticaux de la solution de digestion du tissu dans un tube de centrifugation de 50 ml contenant 10 ml de milieu neuronal primaire préchauffé (tableau 1). Dissocier les tissus corticaux en les pipetant plusieurs fois de haut en bas dans une pipette sérologique, jusqu'à ce qu'une solution homogène sans morceaux de tissu est obtenu. Faire passer la solution de tissu à travers un tamis cellulaire de 70 um pour filtrer les touffes restantes de tissus. Aliquoter la solution de tissu dans 15 mltubes de centrifugation, en ajoutant environ 3 ml dans chaque tube. Ajouter 800 ul de 7,5% de BSA dans du PBS 1x au fond de chaque tube, formant deux couches avec la solution de tissu sur le dessus et au fond de BSA. Centrifuger à 200 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant, aspirant de l'interface des deux couches. Ne pas perturber le culot cellulaire au fond du tube. Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 1 ml de milieu neuronal primaire (tableau 1) et de les combiner dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Déterminer la densité cellulaire en utilisant un hémocytomètre. 6. électroporation et Placage des primaires neurones corticaux NOTE: Le transfert de gènes peut être réalisée en utilisant plusieurs procédés, y compris l'électroporation, la transfection au phosphate de calcium et la transduction virale. Dans ce protocole, nous décrivons l'électroporation pour délivrer CHR2 construction dans les neurones corticaux primaires. Centrifugeuse 6 x 10 6 neurones corticaux de rat unT 200 g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Au moins 6 x 10 6 neurones corticaux sont nécessaires pour l'électroporation d'assurer la formation d'un réseau neuronal par les neurones survivants. Ajouter 100 ul de solution d'électroporation à culot cellulaire et remettre en suspension doucement. Mélanger 100 ul de la suspension cellulaire avec 6 pg de pLenti-Synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmide et transférer dans une cuvette certifié. Éviter de produire des bulles d'air pendant le transfert. Choisir et appliquer programme approprié pour l'électroporation selon les instructions du fabricant. Après électroporation, ajouter 500 pi de MEM à la cellule / ADN suspension à la cuvette. Transférer l'échantillon dans 11,5 ml de milieu neuronal primaire (tableau 1) et remettre en suspension doucement. Le montant total des médias est suffisant pour une plaque de 24 puits entier. Aliquoter 500 pi de milieu pour chaque puits d'une plaque de 24 puits. Incuber la plaque à 37 ° C et 5% de CO 2. </ol> 7. Génération de l'induite cellules souches pluripotentes NOTE:. Cette méthode a été adaptée à partir Okita et al 10 Des fibroblastes humains de culture dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans des plaques à 6 puits. Avant de commencer la reprogrammation des fibroblastes, manteau 6 puits avec du Matrigel et incuber pendant au moins une heure à température ambiante. À 80% de confluence, retirer les supports des cultures de fibroblastes et laver une fois avec PBS 1x. Ajouter une quantité suffisante de trypsine-EDTA 0,25% à couvrir toute la plaque et incuber à 37 ° C pendant 10 min. Une fois que les cellules ont délogé de puits, ajouter deux fois la quantité de DMEM avec 10% de FBS comme celle de la trypsine pour étancher digestion par la trypsine. Délicatement la pipette suspension cellulaire de haut en bas pour briser les cellules. Comptez le nombre de cellules individuelles avec un hémocytomètre. Transfert 7 x 10 5 cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et on centrifuge la suspension de cellules à 200 xg pendant 5min. Retirer le surnageant et remettre en suspension culot cellulaire dans une solution d'électroporation. Électroporer les fibroblastes selon les instructions du fabricant. Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon d'électroporation et ajouter 1 ug de chaque vecteur épisomique. Électroporer cellules avec des paramètres de 1650 V, 10 ms et trois impulsions de temps. Transfert suspension cellulaire dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS et de la plaque 5 x 10 4 cellules par puits d'une plaque à 6 puits. Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2. Après 48 heures, retirer les supports des cultures de fibroblastes transfectées et le remplacer par un milieu mTeSR. Remplacer les milieux de culture tous les jours jusqu'à cellules souches pluripotentes induites (iPSC) colonies sont prêts à être isolé. colonies iPSC peuvent être observés après 28 à 35 jours. Lorsque vous êtes prêt pour l'isolement, couper mécaniquement une colonie iPSC et réensemencer en milieu mTeSR avec 10 uM Rho-kinase associée de protéines (ROCK) inhibiteur (Y-27632) sur revêtu une plaque à 6 puits Matrigel 12. Remplacer milieu de culture quotidienne. 8. Neural induction et le maintien des droits de PNJ NOTE:. Cette méthode a été décrite par Li et al 11 Lorsque les cultures iPSC sont environ 20% de confluence, éliminer le milieu mTeSR et le remplacer par un milieu d'induction neurale (tableau 1). Reconstituer moyenne tous les deux jours. Après sept jours, éliminer le milieu de l'induction neurale et le remplacer par un milieu d'entretien PNJ humaine (tableau 1). Reconstituer moyenne tous les deux jours jusqu'à 7 jours avant repiquage cultures. Avant de repiquage des cultures, des plaques de manteau / flacons avec Matrigel à la température ambiante pendant au moins une heure. Retirez tout support de cultures confluentes NPC humains et laver une fois avec 1x PBS, puis aspirer hors PBS. Ajouter suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits, puis incuber pendant 5 min à 37 ° C. Veiller à ce que toutes les cellules ont détaché. Ajouter deux fois la quantité de DMEM /F-12 que celui de la solution de détachement cellulaire aux puits / flacons. Transfert du DMEM / F-12 contenant les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger 15 ml à 200 xg pendant 5 min. Éliminer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu humaine PNJ de maintenance (tableau 1). Délicatement la pipette suspension cellulaire de haut en bas pour briser les cellules. Plate tiers du nombre total de cellules en culture revêtues Matrigel puits / flacons et l'appoint de taille suffisante complété avec 10 uM Y-27632. Incuber des récipients de culture à 37 ° C et 5% de CO 2. cultures Split 1: 3 tous les 3 à 4 jours et reconstituer moyenne tous les deux jours. Maintenir cultures NPC humaines à haute densité pour empêcher la différenciation. 9. Différenciation des PNJ humaines en neurones dans Co-cultures Ajouter le vecteur lentiviral Synapsin1-tdTomato à la culture humaine PNJ avant de lancer la différenciation en neurones. Préparer astrocytes / neurones corticaux co-culturesune journée à l'avance avant de différenciation PNJ humains. Laver cultures NPC humains une fois avec PBS 1x et ajouter suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits / flacons puis incuber pendant 5 min à 37 ° C. Veiller à ce que toutes les cellules ont détaché. Ajouter deux fois la quantité de DMEM / F-12 que celui de la solution de détachement cellulaire aux puits / flacons. Transférer dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Centrifuger à 200 g pendant 5 min. Éliminer les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu de différenciation neuronale (tableau 1). Délicatement la pipette suspension cellulaire de haut en bas pour briser culot cellulaire en cellules individuelles. Comptez le nombre de cellules individuelles avec un hémocytomètre. Aspirer soigneusement milieu à partir des cultures de neurones corticaux d'astrocytes /. Plate PNJ humains à 5 x 10 3 cellules / cm 2 à 500 pi de milieu de différenciation neuronale (tableau 1) complété avec 10 uM Y-27632 pour chaque 24 puits. Ajouter délicatement milieu contenant PNJ humains dans chaque puitspour éviter de perturber les astrocytes et les neurones corticaux. Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2. Remplacer la moitié du milieu par du milieu frais tous les deux à trois jours pendant au moins 28 jours. 10. électrophysiologiques enregistrements de neurones iPSC dérivés Vérifiez si CSPi humaines se comportent comme des neurones matures. Trouver cellules différenciées de CSPi humaines par la visualisation de tdTomato utilisant un microscope confocal verticale équipé d'un 60X (0,9 NA) de lentille à immersion de l'eau. Tirer pipette d'enregistrement à une résistance de 4 à 6 cellules M. perfuser à température ambiante dans une solution externe (tableau 1) barboter continuellement avec 95% O 2/5% CO 2. Remplir la micropipette avec une solution d'enregistrement interne (tableau 1). Cellulaire Patch tdTomato + en mode cellule entière et l'action d'enregistrement tir potentiel en réponse à l'injection de courant (une durée de 10 secondes, par incréments PA) dans curlouer pince. Confirmez si le potentiel des cellules corticales exprimant ChR2 d'action est fiable évoquée par la stimulation lumineuse. Trouver cellules corticales exprimant ChR2 par visualisation de la GFP sous un microscope confocal. Effectuer cellule entière enregistrement patch clamp sur des cellules corticales en suivant les étapes 10.1.2 à 10.1.3. Vérifiez potentiel d'action est fiable évoquée par éclairage en lumière avec une lampe à arc au mercure (100 W). La longueur d'onde de filtre d'excitation 480/40 nm est. Effectuer une stimulation optogenetic. Patch tdTomato + cellulaire en mode cellule entière et mettre pince de tension à -70mV. Filtrer les signaux actuels à 2 kHz et de numériser à 10 kHz. Surveiller les résistances en série allant de 10 à 20 m de cohérence pendant les enregistrements. Stimuler champ entier de 100 W filtre lampe au mercure à 480/40 nm d'excitation pendant 30 sec. Courants postsynaptiques enregistrement (PSC) de la cellule patchée induite par photostimulation de ChR2 exprimant cor présynaptiqueneurones tiques. Détecter et mesurer les CSP. Définir seuil de l'amplitude et de la zone de courants à 5 Pa et 20 pc respectivement. Inspecter manuellement ces événements pour annuler les traces non-CFP.