Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

OPMERKING: Alle experimenten worden uitgevoerd volgens de protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op SingHealth goedgekeurd. 1. Oogsten vroege postnatale Mouse Brains Voor dissectie Bereid de hippocampus weefsel ontsluitingsoplossing: 10 gl papaïne per 1 ml 1x Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) (+ 1% HEPES) met Deoxyribonuclease I (DNase I) (250 U / ml) en Dispase II (1 U / ml). Voeg ongeveer 2,5 ml van het weefsel ontsluitingsoplossing en filteren met behulp van een 0,20 um filter. Bewaar de oplossing warm bij 37 ° C tot gebruik. Verdoven van de postnatale dag 5 (P5) muizen pups door ze in ijs gedurende 5 min. Verwijderen uit ijs en test voor de pijn reflex via teen of staart knijpen. Spuit de pups met 70% ethanol. Onthoofden de pups en plaats de kop in een petrischaaltje over ijs. Een insnijding in de huid langs de middellijn van de basis van de schedel aan de neus, met een paar kleine scissors of fijne ontleden tang. Schil open de huid en maakt een soortgelijke incisie door de schedel. Voeg twee extra horizontale sneden aan elke kant van de schedel, een rostrale (bij bregma) en een caudaal (de lambda). Schil open de schedel langs de ingesneden lijnen om de onderliggende hersenen bloot te leggen. Gebruik een pincet om de schedel bovenop de olfactorische bollen, en eventuele middellijn bot tussen hen te verwijderen. Doe dit terwijl de kop stabiel met een pincet in de niet-ontleden de hand. Gemak het platte gedeelte van een spatel tussen het ventrale deel van de hersenen en de basis van de schedel aan het caudale einde. Houd de spatel evenwijdig aan de basis van de schedel onder de hersenen, verplaatst richting het rostrale einde van de schedel om eventuele verklevingen tussen de hersenen en de basis van de schedel verbreken. Schep de hersenen met de spatel en plaats deze in een petrischaal met ijskoude 1x EBSS (+ 1% HEPES). Houd weefsels ondergedompeld te allen tijde. Voor iedereenmicro-dissectie stappen, werken onder een dissectie microscoop en gebruik een paar fijne ontleden pincet in elke hand, één voor het snijden van weefsel, en de andere voor het houden van het weefsel stabiel. Maak een snee juist achter de hersenschors te scheiden van de achterhersenen. Knip langs de middellijn aan de hersenschors te scheiden in de twee hersenhelften. Verwijder de hersenvliezen uit de cerebrale hemisferen. Plaats een hemisfeer mediale zijde en plaats de tang in de laterale ventrikel onder de hippocampus. Snijd de middenhersenen weg. Maak snijdt op de bovenste en onderste uiteinden van de hippocampus, en bij de dentate / entorhinale cortex knooppunt de hippocampus van de cortex isoleren. Verzamel de hippocampus in een schotel met ijskoude 1x EBSS (+ 1% HEPES). 2. hippocampus Tissue Dissociatie Breng de hippocampus naar een schotel met de voorverwarmde hippocampus weefsel spijsvertering oplossing. Mince thij hippocampale weefsels zo fijn mogelijk en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Zacht dissociëren weefsels in afzonderlijke cellen door mechanische pipetteren en overdracht cellen in een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer celpellet in 20 ml 0,5 x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met sucrose (0,9 M) en gecentrifugeerd bij 200 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer celpellet in 2 ml NPC onderhoud medium (tabel 1), die bovenop 10 ml 4% runderserumalbumine (BSA) in 1X EBSS-oplossing en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en voeg muis NPC onderhoudsmedium (tabel 1) de cel pellet. Zachtjes pipet op en neer 5-10 keer om ervoor te zorgen cel pellet is opgedeeld in enkele cellen. Overdracht medium dat cellen in vooraf Matrigel beklede platen en voeg epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor 2 (FGF2) (beide 20 ng / ml) heparine (5 mg / ml). Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2. 3. Onderhoud van Adherent Mouse hippocampus NPCs Bereid de gecoate platen / flessen minstens een uur voorafgaand aan de passage muis hippocampus NPCs. Voeg genoeg Matrigel aan het oppervlak van elke plaat of kolf bedekken en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verwijder het afdrukmateriaal uit 90% samenvloeiende muis NPC culturen en een keer wassen met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), dan zuigen PBS uit. Voeg genoeg cel onthechting oplossing zodat iedere put / kolven en incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C. Zorg ervoor dat alle cellen hebben losgemaakt door te kijken onder een omgekeerde helder veld microscoop bij 10X vergroting. Als er nog steeds cellen bevestigd, incubeer cultuur schip voor een verdere 1-2 min en laat cellen weer. Voeg twee keer zoveel Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham's F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F-12)als cel onthechting oplossing van de putjes / flessen nadat alle cellen losgemaakt. Transfer DMEM / F-12 bevattende cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 5 ml muis NPC onderhoudsmedium (Tabel 1). Zachtjes pipet op en neer te breken cel pellet in enkele cellen. Plaat een derde van de totale cellen in nieuwe cultuur putten / flessen en vul voldoende kweekmedium aangevuld met EGF en FGF2. Kweekvaten Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Vullen medium elke tweede dag en splitsen cellen 1: 3 om de 3 tot 4 dagen. Vermijd overmatige groei van de muis NPC culturen om aggregatie en onthechting te voorkomen. 4. differentiatie van muis NPCs in Astrocyten Bereid poly-L-lysine (PLL) / laminin gecoate 12 mm dekglaasjes minstens een dag van tevoren voor het initiëren van differentiatie van de muis NPCs in astrocyten. Cov toevoegenerslips in een 24-well plaat en bedekken gehele oppervlak van putjes met voldoende PLL (1 mg / ml in boraatbuffer). Incubeer de plaat overnacht bij 4 ° C. De volgende dag, verwijder PLL en een keer wassen met 1x PBS. Voeg laminine (1 mg / ml in ijskoude DMEM / F-12), weer die het gehele oppervlak van elk putje en vervolgens geïncubeerd gedurende ten minste 4 uur bij 37 ° C. Verwijder het afdrukmateriaal uit de muis NPC culturen en een keer wassen met 1x PBS vervolgens te zuigen PBS uit. Voeg genoeg cel onthechting oplossing zodat iedere put / kolven en incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C. Zorg ervoor dat alle cellen dan hebben losgemaakt voeg tweemaal de hoeveelheid DMEM / F-12 als cel onthechting oplossing van de putjes / kolven. Transfer DMEM / F-12 bevattende cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml astrocyten differentiatie medium (tabel 1). Zachtjes pipet cel suspension op en neer te breken cel pellet in enkele cellen. Tel het aantal afzonderlijke cellen met een hemocytometer. Plate cellen bij 5 x 10 4 cellen / cm2 in 500 pl medium per putje van een 24-wells plaat. Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2. Vervang de helft van het medium met vers medium om de dag. Muis NPCs snel differentiëren tot astrocyten binnen 2 dagen en worden gedifferentieerd voor een week voor aanvang van verdere experimenten. 5. Oogsten Embryonale Rat Brains en Cortical Tissue Dissociatie Verwijder astrocyt differentiatie medium (tabel 1) van astrocyten en vervang primaire neuron medium (tabel 1) ten minste 4 uur voor het begin oogst van embryonale rattenhersenen. Voor dissectie Bereid de corticale weefsel ontsluitingsoplossing: 10 gl papaïne per 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES) met 12,1 mg / ml L-cysteïne. Maken ongeveer 20,5 ml van het weefsel ontsluitingsoplossing en filteren met behulp van een 0,20 um filter. Bewaar de oplossing warm bij 37 ° C tot gebruik. Euthanaseren de zwangere dam door kooldioxide stikken met behulp van samengeperst gas. Test voor de pijn reflex via teen of staart knijpen. Leg het dier ventrale zijde naar boven op een absorberend kussen en genieten van haar buikstreek met 70% ethanol. Huidplooi met een pincet en een laterale incisie met een paar chirurgische schaar, breed genoeg om de buik bloot. Pak het buikvlies met de tang en opengesneden de buikholte. Til de baarmoeder hoorn met de tang en snijd deze gratis langs de mesometrium. Plaats de ontleed baarmoeder in een petrischaal over ijs. Scheid elk embryo hierdoor de baarmoeder weefsel daartussen. Maak een insnijding in de embryonale weg. Voorzichtig de dop van de foetus door de opening. Onthoofden de foetus en plaats het hoofd in een petrischaal over ijs. Om embryon oogstenic de hersenen van ratten, volg dan de beschrijving van de stappen 1,3 tot 1,5. Om corticale weefsels ontleden, plaats een hersenhelft laterale kant naar boven. Snijd het halfrond in twee zijdelings uit het midden. Gooi helft dichter bij de basis van de hersenen. Trim het weggesneden weefsel aan de middenhersenen te verwijderen. Breng de corticale weefsel om een ​​schotel met de voorverwarmde corticale weefsel spijsvertering oplossing. Hak de corticale weefsels zo fijn mogelijk en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Breng het corticale weefsel van het weefsel ontsluitingsoplossing in een 50 ml centrifugebuis die 10 ml voorverwarmde primaire neuron medium (tabel 1). Distantiëren de corticale weefsels door herhaaldelijk pipetteren ze op en neer in een serologische pipet tot een homogene oplossing zonder stukken weefsel wordt verkregen. Passeert het weefsel oplossing door een 70 micrometer cel zeef om te filteren op de resterende weefsel klonten. Aliquot het weefsel oplossing in 15 mlcentrifugebuizen, toevoeging van ongeveer 3 ml per buisje. Voeg 800 gl 7,5% BSA in 1x PBS onderaan elke buis, die twee lagen met het weefsel oplossing boven en BSA onderaan. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, opzuigen van het grensvlak van de twee lagen. Storen de cel pellet op de bodem van de buis. Resuspendeer elk celpellet in 1 ml primaire neuron medium (tabel 1) en gecombineerd in 15 ml centrifugebuis. Bepaal de celdichtheid met behulp van een hemocytometer. 6. Electroporatie en Plating van primaire corticale neuronen OPMERKING: Genoverdracht kan worden verkregen door verschillende werkwijzen, waaronder elektroporatie, calciumfosfaat transfectie en virale transductie. In dit protocol beschrijven we elektroporatie leveren ChR2 construct in primaire corticale neuronen. Centrifuge 6 x 10 6 rat corticale een neuronenT 200 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Ten minste 6 x 10 6 corticale neuronen vereist elektroporatie om de vorming van een neuronaal netwerk te verzekeren door overlevende neuronen. Voeg 100 ul van elektroporatie oplossing voor pellet cel en opnieuw in suspensie voorzichtig. Combineer 100 pi van de celsuspensie met 6 ug pLenti-synapsine-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmide opnemen en overbrengen naar een gecertificeerd cuvet. Vermijd het produceren van luchtbellen tijdens de overdracht. Selecteren en geschikt programma aanvragen elektroporatie volgens de instructies van de fabrikant. Na elektroporatie, voeg 500 pl MEM naar cel / DNA suspensie aan de cuvet. Breng het monster in 11,5 ml primaire neuron medium (tabel 1) en opnieuw in suspensie voorzichtig. De totale hoeveelheid media is voldoende voor een volledige 24-wells plaat. Aliquot 500 ul van medium voor elke well van een 24-wells plaat. Incubeer plaat bij 37 ° C en 5% CO2. </ol> 7. Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen OPMERKING:. Deze methode is aangepast van Okita et al 10 Cultuur humane fibroblasten in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in 6-well platen. Voordat met herprogrammering van fibroblasten, laag 6 putjes met Matrigel en incubeer gedurende ten minste een uur bij kamertemperatuur geroerd. Bij 80% samenvloeiing, verwijder media uit fibroblastculturen en een keer wassen met 1x PBS. Voeg voldoende 0.25% trypsine-EDTA gehele bord bedekken en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min. Wanneer cellen losgeraakt van putten, voeg tweemaal de hoeveelheid DMEM met 10% FBS als trypsine trypsine digestie blussen. Zachtjes pipet celsuspensie op en neer te breken cellen. Tel het aantal afzonderlijke cellen met een hemocytometer. Transfer 7 x 10 5 cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer de celsuspensie bij 200 xg gedurende 5min. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in elektroporatie oplossing. Electroporate fibroblasten volgens de instructies van de fabrikant. Resuspendeer cellen in 100 pl elektroporatie buffer en voeg 1 pg van elk episomale vector. Electroporate cellen met de instellingen van 1650 V, 10 ms en 3 keer pulsen. Overdracht celsuspensie in DMEM aangevuld met 10% FBS en plaat 5 x 10 4 cellen per putje van een 6-wells plaat. Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2. Na 48 uur, verwijder media uit getransfecteerde fibroblastculturen en te vervangen door mTeSR medium. Vervang voedingsbodems dagelijks tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kolonies zijn klaar om te worden geïsoleerd. iPSC kolonies kunnen worden waargenomen na 28-35 dagen. Wanneer klaar voor isolatie, mechanisch snijden een iPSC kolonie en zaaien in mTeSR medium met 10 uM Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) inhibitor (Y-27632) op een Matrigel beklede 6-well plaat 12. Vervang kweekmedium dagelijks. 8. Neurale Inductie en onderhoud van menselijke NPCs Opmerking. Deze werkwijze is beschreven door Li et al 11 Wanneer iPSC culturen zijn ongeveer 20% samenvloeiing, verwijder mTeSR medium en vervang neurale inductie medium (tabel 1). Vullen elke tweede dag medium. Na 7 dagen, verwijder neurale inductie medium en vervang met menselijke NPC onderhoud medium (tabel 1). Vullen medium om de dag tot 7 dagen vóór passage culturen. Vóór passeren van culturen, laag platen / kolven met Matrigel bij kamertemperatuur gedurende ten minste een uur. Verwijder het afdrukmateriaal uit samenvloeiende menselijke NPC culturen en een keer wassen met 1x PBS vervolgens te zuigen PBS uit. Voeg genoeg cel detachement oplossing te dekken alle putjes vervolgens incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Zorg ervoor dat alle cellen hebben losgemaakt. Voeg tweemaal het bedrag van DMEM /F-12 als cel onthechting oplossing van de putjes / kolven. Transfer DMEM / F-12 bevattende cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml humaan NPC onderhoudsmedium (Tabel 1). Zachtjes pipet celsuspensie op en neer te breken cellen. Plaat een derde van de totale cellen in Matrigel gecoate cultuur putten / flessen en vul voldoende medium aangevuld met 10 uM Y-27632. Kweekvaten Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Split kweken 1: 3 om de 3 tot 4 dagen en vullen medium elke andere dag. Handhaaf de menselijke NPC culturen bij hoge dichtheid om differentiatie te voorkomen. 9. Differentiatie van Human NPCs in Neuronen in co-culturen Voeg de lentivirale vector Synapsin1-tdTomato menselijke NPC cultuur voor het begin van differentiatie in neuronen. Bereid astrocyte / corticale neuron co-cultureneen dag van tevoren vóór differentiëren menselijke NPC's. Was menselijke NPC kweken eenmaal met 1x PBS en voeg voldoende mobiele onthechting oplossing aan alle putjes cover / kolven vervolgens geïncubeerd gedurende 5 min bij 37 ° C. Zorg ervoor dat alle cellen hebben losgemaakt. Voeg twee keer de hoeveelheid DMEM / F-12 als cel onthechting oplossing van de putjes / kolven. Breng in een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml neuronale differentiatie medium (tabel 1). Zachtjes pipet celsuspensie op en neer te breken cel pellet in enkele cellen. Tel het aantal afzonderlijke cellen met een hemocytometer. Zorgvuldig aspireren medium uit astrocyten / corticale neuron culturen. Plate menselijke NPC bij 5 x 10 3 cellen / cm2 in 500 pi van neuronale differentiatie medium (tabel 1) aangevuld met 10 pM Y-27632 per 24-well. Toe zachtjes medium dat de menselijke NPC's in elk putjeom te voorkomen dat het verstoren van de astrocyten en corticale neuronen. Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2. Vervang de helft van het medium met vers medium elke twee tot drie dagen gedurende ten minste 28 dagen. 10. elektrofysiologische registraties van iPSC-afgeleide Neuronen Bevestigen of menselijk iPSCs gedragen als volwassen neuronen. Vind cellen onderscheiden van menselijk iPSCs door visualisatie van tdTomato behulp van een rechtopstaande confocale microscoop uitgerust met een 60x (0.9 NA) onderdompeling in water lens. Registratiemodule pipet een weerstand van 4-6 M. perfuseren cellen bij kamertemperatuur in een externe oplossing (Tabel 1) geborreld constant met 95% O2 / 5% CO2. Vul de opname micropipet interne oplossing (Tabel 1). Patch tdTomato + cel in whole-cell-modus en opnemen actiepotentiaal afvuren in reactie op de huidige injectie (1 sec duur, stappen van 10 Pa) in curhuren klem. Bevestigen als actiepotentiaal van corticale cellen die ChR2 betrouwbaar wordt opgeroepen door licht stimulatie. Zoek corticale cellen die ChR2 door visualisatie van GFP onder een confocale microscoop. Voeren whole-cell patch clamp opname op corticale cellen door volgende stappen 10.1.2 naar 10.1.3. Controleer actiepotentiaal wordt betrouwbaar opgeroepen door licht verlichting met kwik booglamp (100 W). De golflengte van excitatie filter 480/40 nm. Voeren optogenetische stimulatie. Patch tdTomato + cel in whole-cell-modus en stel de spanning klem op -70mV. Filter huidige signalen op 2 kHz en digitaliseren bij 10 kHz. Monitor serieweerstand variërend van 10 tot 20 M consistentie tijdens opnames. Stimuleer hele veld met 100 W kwiklamp met 480/40 nm excitatie filter voor 30 sec. Record postsynaptische stromingen (PSC) van gepatchte cel veroorzaakt door fotostimulatie van ChR2 expressie presynaptische corsche neuronen. Detecteren en meten van PSC's. Stel drempel voor amplitude en stromingen gebied op 5 PA en 20 pct, respectievelijk. Handmatig controleren deze gebeurtenissen op elke niet-PSC sporen weggooien.