مقاربة Optogenetic لتقييم تشكيل الوصلات العصبية في نظام المشارك الثقافة
Summary
A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.
Abstract
Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.
Introduction
في السنوات الأخيرة، وقد أحدثت ثورة في فهمنا من الخلايا العصبية والخلايا العصبية وظيفة الدوائر بواسطة عدة أدوات optogenetic التي تتحكم في استثارة الخلايا العصبية. واحدة من هذه الأداة هي القناة الموجبة لتنشيط ضوء، channelrhodopsin-2 (ChR2): الخلايا العصبية معربا عن ChR2 إمكانات العمل النار ردا على التحفيز خفيفة 1-3. لأن الخلايا العصبية ليست حساسة عادة للضوء، وهذه القدرة الرائعة تفتح آفاقا جديدة لمكافحة الزمانية والمكانية دقيقة لنشاط السكان محددة وراثيا من الخلايا العصبية (4) ولقد تسارعت بشكل كبير من الدراسات وظيفة الدماغ. وقد تم تطبيق ChR2 لأبحاث الخلايا الجذعية لأغراض مختلفة، من رصد التنمية العصبية 5 إلى تنظيم نشاط الشبكات العصبية 6.
نحن هنا تستخدم ChR2 لزيادة فائدة نظام شارك في ثقافة العصبية. تمكن أنظمة شارك في ثقافة تقييم التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا.شارك الثقافات من الخلايا العصبية والدبقية، أنواع الخلايا الرئيسية للجهاز العصبي، وتستخدم عادة للتحقيق مما يشير بين هذه أنواع مختلفة من الخلايا، وكذلك لتقييم أهمية هذه الإشارات لالاستجابات الفسيولوجية، والإكثار من الضرر ودراسة الآليات الجزيئية التي يحتمل أن تشارك في هذه إشارات 7. وكشفت دراسة سابقة أن iPSCs الإنسان تفرق بسرعة كبيرة في الخلايا العصبية في وجود ثقافة تحتوي على الخلايا العصبية الفئران القشرية الأولية، الخلايا النجمية، قليلة التغصن، والخلايا الدبقية الصغيرة 8.
في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود طريقة التي تستخدم ChR2 في نظام شارك في ثقافة لاستجواب الاتصالات المشبكية بين الخلايا العصبية والخلايا العصبية القشرية الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة من صنع الإنسان (iPSCs). وصفنا خطوات لتشريح وأنسجة المخ الحصاد 9 وكذلك للحفاظ على وتفرق الماوس الخلايا الاصلية العصبية (الشخصيات) في الخلايا النجمية والشخصيات البشرية كثافة العملياتس الخلايا العصبية لخلق نظام المشاركة في الثقافة. لإنشاء هذا النظام المشترك والثقافة، واستخدمنا طريقة إعادة برمجة خالية من التكامل وصفها أوكيتا وآخرون. 10 لتوليد iPSCs الإنسان. ثم تم ميز هذه iPSCs بكفاءة في اللجان التحضيرية الوطنية في ظروف محددة كيميائيا باستخدام مثبطات الصغيرة جزيء كما وصفها لي وآخرون. 11
في الثقافات المشترك، يمكن التعرف على مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية عن طريق الكشف عن ChR2 التعبير في الخلايا العصبية القشرية ووضع علامات على الخلايا العصبية IPSC المشتقة عن طريق بروتين الفلورسنت، جنبا إلى جنب ديمر الطماطم (tdTomato). الجمع بين التسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية IPSC المستمدة مع ضوئي optogenetic من الخلايا العصبية القشرية يسمح تقييم قدرة هذين النوعين من الخلايا العصبية لتشكيل الدوائر مع بعضها البعض. على وجه التحديد، ضوئي من ChR2 معربا عن الخلايا العصبية القشرية تثير ردود متشابك في الخلايا العصبية IPSC المشتقة التي شكلت الدوائر متشابكمع شبكة الخلايا العصبية القشرية photostimulated. علينا أن نبرهن على زيادة التيارات بعد المشبكي يتم الكشف عنها بالفعل في الخلايا العصبية IPSC المشتقة في ظل هذه الظروف. هذا البروتوكول يسمح تقييم الدوائر متشابك في إطار مجموعة من الظروف التجريبية، بما في ذلك خلاصة من نماذج مختلفة المرض العصبية باستخدام iPSCs المستمدة من الخلايا الليفية من المرضى المرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
علم البصريات الوراثي يوفر الدقة الزمنية والمكانية لتفعيل السكان محددة من الخلايا العصبية (13). في تجاربنا، كانت مضاءة الحقل بأكمله من الهدف المجهر لمدة 30 ثانية إلى الصور تحفيز الخلايا العصبية القشرية الوحيدة معربا عن ChR2. وهذا ما سمح لنا لتحديد ما إذا تم تشكيل اتصالات متشابك بين مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية داخل الثقافة المشتركة. كشفت نتائجنا أن ضوئي يزيد تردد PSC في الخلايا العصبية IPSC المشتقة، والذي يدل على أن هذه الخلايا العصبية تستقبل مدخلات متشابك من الخلايا العصبية القشرية قبل المشبكي معربا عن ChR2. وهذا، بدوره، على أن الخلايا العصبية IPSC المستمدة من دمج بنجاح في الدوائر مع الخلايا العصبية القشرية.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة لتوليد هذا النظام المشترك الثقافة. من المهم للتأكد من أن الثقافات نجمية الماوس NPC المستمدة من يتمتعون بصحة جيدة، مع الحد الأدنى من موت الخلايا، قبل الشروع في الطلاءمن أنواع الخلايا الأخرى. العصبونات القشرية والشخصيات البشرية نعلق كذلك على الخلايا النجمية صحية والتسجيلات الكهربية تعتمد بشكل كبير على الظروف الثقافة. الخطوات الرئيسية الأخرى في هذا البروتوكول هي Electroporation للوالطلاء من الخلايا العصبية القشرية على الثقافات نجمية. كما عدد كبير من الخلايا تموت بعد Electroporation لل، فمن المهم التأكد من أن 6 ملايين على الأقل العصبونات القشرية وelectroporated لتصفيح على الثقافات نجمية في 24 لوحات جيدا. وقد لاحظنا أنه عندما تم electroporated أقل من 6 ملايين الخلايا، وعدد الخلايا العصبية التي البقاء على قيد الحياة لم تشكل شبكة العصبية الكثيفة، والتي أثرت التسجيلات الكهربية. وينبغي أيضا أن يكون عدد الخلايا العصبية القشرية electroporated ثابت لكل تجربة ثقافة مشتركة للسماح للمقارنة بين الدراسات المختلفة. لجميع الخطوات التي تنطوي على الهضم الأنزيمي، فمن الضروري عدم ترك الخلايا في حل الهضمي لفترة طويلة جدا لأنها قد تؤدي إلى موت الخلايا.
هذايمكن استخدام نهج لفحص قدرة الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الليفية المريض محددة لتشكيل اتصالات متشابك مع الخلايا العصبية الأخرى. الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الليفية من المرضى الذين يعانون من اضطراب النمو العصبي ريت المكتسب (RTT) يحمل عيوب انتقال متشابك: الخلايا العصبية RTT يحمل انخفاض ملحوظ في وتيرة PSC والسعة مقارنة مع الخلايا العصبية السليمة، ويفترض نظرا لأقل اتصال متشابك 14. يسمح نظامنا شارك في ثقافة فحص آثار المخدرات على الخلايا العصبية التي تظهر العيوب الخلقية. هذا يمكن القيام بها عن طريق إضافة مركبات من الفائدة خلال زرع البذور من الشخصيات البشرية المريضة وكذلك خلال التعرض المستمر لمركبات طوال الوقت من تمايز الخلايا العصبية.
في حين أن هذا النظام شارك في الثقافة يمكن أن تستخدم أيضا بوصفها نموذجا لاختبار المخدرات، وجود قيود مع هذا النهج هو أن عملية التحقيق في آثار كل مجمع مرشح يمكن أن تكون طويلة ومملة كماأنها ليست طريقة الفرز الإنتاجية العالية. بعد العلاج مع مركبات مرشح، الخلايا العصبية IPSC المشتقة يجب أن تكون مصححة بشكل فردي لتحديد الآثار المترتبة على كل مجمع على شركات الأمن الخاصة. وعلاوة على ذلك، هناك حاليا العديد من الخلايا الليفية لا المتاحة وiPSCs من المرضى. ولذلك، فإنه سوف تكون ذات فائدة في المستقبل القريب أن يكون أكثر خلايا المريض وأيضا على التكيف مع هذا البروتوكول لارتفاع الفرز الإنتاجية. على سبيل المثال، من خلال وصفها الخلايا العصبية IPSC المشتقة مع مؤشر النشاط، مثل أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا من الأيونات أو غشاء المحتملة، سيكون من الممكن زيادة معدل الإنتاجية بشكل كبير عن طريق إجراء الكهربية تستغرق وقتا طويلا، خطوة جانبية. كما أن العملية برمتها لتوليد هذا النظام شارك في الثقافة، من إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى أداء التسجيلات الكهربية، يتطلب أكثر من 90 يوما، فمن المستحسن أن إما iPSCs الإنسان أو الشخصيات يتم توسيع، بعد إعادة برمجة والخطوات تحريض العصبية على التوالي،وcryopreserved إلى تقليص الوقت اللازم لإجراء التجارب في المستقبل.
في تجاربنا، عبرنا عن ChR2 في الخلايا العصبية القشرية تحت المروج synapsin1. لأن هذا هو المروج لعموم العصبية، ونحن يفترض تم photostimulating كل من الخلايا العصبية القشرية المثبطة ومثير. إذا كان الهدف من التجارب في المستقبل هو لاستجواب تحديدا الدوائر إما المثبطة أو مثير، يمكن أن تستخدم المروجين أكثر تحديدا. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على الخلايا العصبية القشرية من المعدلة وراثيا (أو حقن فيروس الفئران) حيث يتم استهداف ChR2 التعبير خصيصا لمجموعات سكانية فرعية محددة وراثيا من الخلايا العصبية. على سبيل المثال، أعربت الأنسجة القشرية حصاد من ماوس التي لديها لجنة المساواة العرقية recombinase في interneurons التي تحتوي على parvalbumin (interneurons PV) التي عبرت مع ماوس مع floxed ChR2 سوف تسفر عن الحالة التي تكون فيها الخلايا العصبية القشرية الوحيدة معربا عن ChR2 سيكون interneurons PV 15. استخدام هذا ChR2 معربا عن interneurons في مشاركتنا في مكعبسوف نظام lture تمكين تحديد ما إذا كانت الخلايا العصبية مصححة IPSC المشتقة هي قادرة على أن تدرج في الدائرة مع interneurons PV.
واستنادا إلى دراسة سابقة 9، الخلايا العصبية القشرية ناضجة مع تداخل التشعبات بعد 14 يوما في المختبر. وهكذا، إذا لا ضوئي حصول على رد من الخلايا العصبية مصححة IPSC المشتقة، فإنه ينبغي أن تشير إلى أن الخلايا العصبية لا يملك القدرة على إجراء اتصالات متشابك مع الخلايا العصبية القشرية. والخلايا العصبية IPSC المشتقة هي قادرة على الحصول على مدخلات متشابك إما من الخلايا العصبية IPSC المشتقة الأخرى أو العصبونات القشرية. إذا استخدمت التصحيح التقليدي التسجيلات المشبك، فإنه لن يكون من الممكن التمييز حيث مدخلات متشابك قادم من. ميزة نظامنا هو أن الردود بعد المشبكي من المدخلات قبل المشبكي القشرية يمكن أثار انتقائي والتعرف. توفر الإجراءات المذكورة هنا مقاربة بسيطة لتقييم قدرة الخلايا العصبية IPSC المشتقة لدمجإلى شبكة الخلايا العصبية المحددة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر K. Deisseroth وS. جي للChR2 وSynapsin1-tdTomato يبني lentiviral على التوالي، C. تشاي لتبادل الخبرات وبروتوكول بشأن الجيل IPSC، WY يونغ للدعم الفني، وأعضاء المختبر جوه للمواد تقاسم والخبرات. وأيد هذا العمل من قبل ابوت التغذية ومركز الأكاديمية للتميز (ACE) على جائزة بحثية من شركة جلاكسو سميث كلاين (GSK) لELG، من مؤسسة أبحاث سنغافورة الوطنية في إطار برنامجها للبحوث التنافسية (جبهة الخلاص الوطني 2008 جبهة الخلاص الوطني-CRP 002-082) إلى ELG و GJA، ومعهد عالمي (WCI) برنامج المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني) بتمويل من وزارة التعليم والعلوم والتكنولوجيا في كوريا (MEST) (جبهة الخلاص الوطني جرانت رقم: 2009-003 WCI) إلى GJA
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 | |
References
- Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
- Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -. C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
- Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
- Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935 (2012).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
- Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
- Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).
