في حقن الرحم البينية القلب الطماطم كتين على أجنة الفئران لقياس تدفق الدم الكلوي
Summary
This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.
Abstract
ودراسة سلوكه إلى حد كبير في تشكيل ونضح تطوير الأوعية الدموية الكلوية (بصرف النظر عن الكبيبات). ومع تطور الأوعية الدموية عبر الأوعية الدموية (والذي هو المتفرعة الخروج من السفن الكبرى) وتكون الأوعية (دي نوفو تشكيل السفينة)، تم تقنيات رسم الخرائط نضح مثل يلقي الراتنج، في الجسم الحي التصوير بالموجات فوق الصوتية، والصغرى تشريح محدودة في مما يدل على العلاقات الحميمة بين هاتين العمليتين والهياكل الكلى النامية في الجنين. هنا، نحن تصف إجراءات في الرحم داخل القلب الموجهة بالأمواج فوق الصوتية-FITC المسمى الطماطم إبر دقيقة جدا كتين على أجنة الفئران لقياس مدى تطور الجنين من نضح الكلوي. تم perfused لكتين الطماطم (TL) في جميع أنحاء الجنين والكلى المقطوع. وقد شارك في الأنسجة الملون لمختلف الهياكل الكلى بما في ذلك: الأسلاف نفرون، والهياكل كليون، الحالبي ظهارة، والأوعية الدموية. ابتداء من الساعة E13.5 السفن ذات عيار كبير وperfused ل، ومع ذلك المحيطيوظلت السفن unperfused. قبل E15.5 وE17.5، بدأت السفن المحيطية الصغيرة وكذلك الكبيبات لتصبح perfused ل. هذه التقنية التجريبية أمر بالغ الأهمية لدراسة دور الأوعية الدموية وتدفق الدم أثناء التطور الجنيني.
Introduction
أثناء التطور الجنيني تأخذ اثنين منفصلة، ولكن في وقت واحد، وعمليات الأوعية الدموية المكان: الأوعية الدموية، العملية التي تنمو سفينة من رئيسي موجودة من قبل السفينة، وتكون الأوعية، وهو تشكيل من جديد من السفن من الأسلاف البطانية السكنية 1،2. على التوالي، والسابق هو مرادف مع تدفق الدم، في حين يعتقد هذا الأخير أن يأخذ مكان إلى حد كبير في غياب ذلك.
في وقت واحد لتشكيل الأوعية الدموية، عملية دورية وديناميكية من التوليف السلف الكلى خلية، والانتشار، والتمايز تبدأ تتكشف في يوم الجنينية 9.5 (E9.5). في هذه المرحلة مهدها الحالبي (UB) يغزو ظهريا إلى المحيطة اللحمة المتوسطة الكلوة التالية (MM)، ويستمر حتى الولادة 3. كرر المتفرعة من UB إلى التكثيف بسرعة الكلوة التالية سقف اللحمة المتوسطة يبدأ تشكيل وحدات وظيفية في الكلى، وكليون. مع كل جيل جديد من UB وnephرون، وتشرد الأجيال الأكبر سنا في المناطق القشرية والنخاعية الداخلية، حيث ثم الخضوع لمزيد من النضج والتمايز داخل البيئات في المقام الأول الأوعية الدموية-الكثيفة. كما يتضح من دريسلر وآخرون. 3، وعجلت هذه العملية الجنينية التي كتبها إشارات الاستقرائي، مثل الحديث المتبادل بين UB وMM، وعدد لا يحصى من العوامل خارج الخلية 3-6. عاملين خارج الخلية التحقيق مؤخرا داخل البنكرياس النامية والكلى وتشمل توتر الأكسجين وتدفق الدم 7،8. وسيتم مناقشة هذا الأخير في مزيد من التفاصيل أدناه مع يتعلق بالتنمية الكلى.
من أجل فضح دور الاستقرائي أن تدفق الدم يلعب يحتمل أن تكون في كليون السلف تمايز الخلايا، وكذلك في عمليات توالد الأعضاء الأخرى، وأساليب محددة ودقيقة لرسم الخرائط الجنينية تدفق الدم أمر حتمي.
طرق بديلة لقياس تدفق الدم وتشمل وصفة طبية من المجاهدينالتصوير trasound والراتنج يلقي 9،10. قاطع، وقد ثبت هذه الأوضاع أن هناك نقصا بطبيعتها في قدرتها على كشف بالتزامن تجاورات الزمانية والمكانية بين تدفق الدم وتمايز الخلايا الجذعية. يلقي الراتنج، وعلى سبيل المثال، تقدم نموذجا صالحا من الزخرفة سفينة داخل أنسجة البالغين، ولكن في السفن غير الناضجة، مثل مع النقاط الزمنية الجنينية، والسفن هي تعاني من التخلف الشديد وتتسرب منها المياه. ولذلك، الراتنج يلقي تفشل في عقد داخل الأوعية الصغيرة، التي يسهل اختراقها في كثير من الأحيان.
لهذه العقبات واضحة، من بين أمور أخرى، اخترنا أن تدرج في الجسم الحي داخل القلب الجنينية كتين الطماطم (TL) إبر دقيقة جدا في تحقيقاتنا التنمية الكلى الموجهة بالأمواج فوق الصوتية. في هذا الإجراء نستخدم مسبار الموجات فوق الصوتية لتوجيه متزامن إبرة ممص مكروى شنت مليئة 2.5 ميكرولتر من حل TL إلى البطين الأيسر من أجنة الفئران في نقاط E11.5، E13.5، E15.5، والوقت E17.5. E17.5 هو أحدث سن التنموي مثل الإبر ليست قوية بما فيه الكفاية لاختراق الجنين أكثر تطورا.
مزايا هذه الطريقة حقن مكروي وفيرة. الموجهة بالأمواج فوق الصوتية حقن مكروي يسمح تحديد المواقع بدقة من إبرة الحقن داخل البطين الأيسر الجنينية، طرد السلبي ورقابة من حل في القلب النابض للحيوان، والضرر الحد الأدنى من القلب والأنسجة المحيطة بها، وتجنب الفشل القلبي المفاجئ وفاة الجنين قبل التروية كامل الجسم. مع استخدام TL FITC المسمى، فإن أي الأوعية الدموية perfused لتحافظ على علامة على طول الغشاء القمي البطانية. في تركيبة مع المناعية، وذلك باستخدام PECAM (CD31، صفائح الدم البطانية جزيء التصاق الخلية) ومختلف علامات الأوعية الدموية الأخرى، ونحن قادرون على التمييز بوضوح بين السفن perfused لوالامم المتحدة وperfused ل، فضلا عن تميز أي تلطيخ الشاذة من الأنسجة المحيطة بها.
Protocol
Representative Results
Discussion
التخدير حقن مكروي والإطار الزمني
وفيما يتعلق تخدير الأم، فمن الضروري للحفاظ على ثبات تدفق الهواء (2-3 لتر / دقيقة) وعند انخفاض PSI. يجب أن تعقد تدفق مهدئ في حوالي الساعة 1،75 حتي 2 لتر / دقيقة. في وقت واحد والأطر الزمنية التي الحقن تتم يج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children’s Hospital of Pittsburgh.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5µL / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat ) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
- Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
- Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
- Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).
- Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).
- Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).
- Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
- Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).
- Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).
- Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).
