De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

Lymfe stroomt van de dunne darm via een unidirectionele proces beginnend op één melkvaten die zijn opgenomen in elke kleine darmvlokken ^1. Melkvaten zijn relatief doorlaatbaar voor vocht, macromoleculen en cellen en de lymfe formatie dus begint met de komst van deze factoren in melkvaten. De eerste lymfe in de melkvaten stroomt vervolgens uit de darm via een netwerk van lymfatische haarvaten, verzamelen (afferente) lymfevaten, een reeks mesenteriale lymfeklieren en uiteindelijk de post-nodale (efferente) lymfevaten. Binnen de knooppunten, lymfe gaat door een reeks medullaire sinussen waarbij uitwisseling plaatsvindt met knooppunt resident immuuncellen en materiaal die het knooppunt uit het bloed. Alle lymfe stroomt uit de dunne darm uiteindelijk convergeert naar de efferente superieure mesenteriale lymfe kanaal en vervolgens de cisterna chyli. De Cisterna chyli verzamelt tevens lymfedrainage de caudale perifere weefsels, INTESTinal, lever- en lumbale regio's en voegt zich bij de thoracale lymfe kanaal samen met lymfe uit het mediastinum en craniale delen van het lichaam. De thoracale lymfe kanaal uitmondt lymfe rechtstreeks in het veneuze systeem bij de verbinding van de linker interne halsader en subclavia. Faciliteert de hier beschreven protocol, waarin de collectie van lymfe direct in staat stelt van de superieure mesenteriale lymfe kanaal, waardoor de analyse van de verschillende factoren die rechtstreeks op doorreis vanuit de darm naar de systemische (algemene) circulatie via de intestinale lymfestelsel.

De belangrijkste fysiologische functies toegewezen aan de intestinale lymfestelsel zijn om de vochtbalans te behouden, om lipide en lipofiel molecuul absorptie te vergemakkelijken, en om passende immuunreacties ¹ mogelijk te maken. Tumorcellen en virussen ook verspreiden via de intestinale lymfevaten ^2-4 en belangrijke wijzigingen voordoen in de lymfevaten in verschillende inflammatoire en metabolische ziekten ^5-7. Kannulation van de mesenteriale lymfe kanaal om de lymfe te verzamelen binnen het mesenterium maakt een analyse van bulk vloeistofstroom via de intestinale lymfevaten evenals kwantificering van de concentratie en het vervoer tarief van verschillende cellen en moleculen. Wijzigingen in de concentratie of doorvoer van die factoren als reactie op verschillende uitdagingen (bijvoorbeeld diëten, antigenen, drugs) en ziektemodellen (bijvoorbeeld colitis, HIV, diabetes) kan ook worden beoordeeld. Hoewel het onmogelijk is elke lymfe component die kan worden geanalyseerd en vergeleken hier uitgebreid beschreven, mesenterische lymfklieren simplistisch uit waterige, lipiden en cellulaire fasen. Onderdelen van belang in de waterige fase omvatten peptiden en eiwitten zoals antigenen of tolerogenen ^8, immuun boodschappers zoals cytokinen en mestcel mediatoren ⁹ en metabole mediatoren zoals incretines ^10. De cellulaire fractie van de post-nodale mesenteriale lymfeklieren bestaat bijna volledig (meer dan 99%) van lymphocytes ^11. Verscheidene immuuncellen (dendritische cellen, mestcellen, etc.) voert de pre-nodale mesenterische lymfevaten maar binnen het knooppunt ¹² blijven. Indien de cellen in afferente lymfe van belang, is het mogelijk om deze cellen te verzamelen door verwijdering van de mesenterische lymfeklieren enkele dagen voor canulatie van de mesenterische lymfklieren kanaal ^12. Zo de afferente en efferente lymfevaten zijn direct verbonden en de lymfe cellen in afferente lymfe direct doorgeven aan de mesenterische lymfklieren kanaal. De doorvoer en fenotype van verschillende immuuncellen die door de intestinale lymfevaten kan dus worden onderzocht. Wellicht wordt aangevoerd verzamelen mesenterium actueel meest voorkomende reden is echter de intestinale verwerking, opname en het transport van voedingslipiden en lipofiele moleculen ¹⁰ bestuderen.

Na inslikken wordt voedingslipiden gedigereerd (bijvoorbeeld van triglyceride vetzuren en monoglyceride, Phospholipid vetzuren en lysofosfolipide en cholesterol ester tot vetzuur en cholesterol, etc.) en gedispergeerd in het darmlumen in kleine micellen en vesiculaire structuren door de toevoeging van amfifielen van gal (fosfolipiden, cholesterol en galzouten) en de werking van pancreasenzymen ^10,13. Vanaf hier zijn ze opgenomen in enterocyten. Een deel van de geabsorbeerde componenten worden opnieuw veresterd aan triglyceriden, fosfolipiden en cholesterol esters in het absorberende cellen (enterocyten) vormen. Deze opnieuw veresterd lipiden zijn opgebouwd uit een combinatie van exogeen ingenomen lipidecomponenten en endogene lipide componenten van de gal uitgescheiden, mucosale lipidendepots of intestinale bloedtoevoer ^13. Vanaf hier de veresterde lipiden zijn ofwel opgeslagen in enterocyten of geassembleerd tot intestinale lipoproteïnen (chylomicronen, zeer lage dichtheid lipoproteïnen (VLDL)) samen met diverse apoproteins en andere lipofiele moleculen ( <em> bijvoorbeeld, vitaminen) ^10,13. Na enterocyten verlaten, worden lipoproteïnen bijzonder van de darm getransporteerd naar de systemische circulatie via de mesenterische lymfatische systeem de intestinale melkvaten meer doorlaatbaar voor binnenkomst dan de intestinale bloedvaten. Een deel van de geabsorbeerde lipiden componenten worden ook via het bloed haarvaten en poortader als één niet-lipoproteïne geassocieerd vervoerd vanuit de darm naar de systemische circulatie, moleculen ^14. In het algemeen echter, de poortader transportroute slechts een belangrijke speler in de absorptie van korte en middellange ketenlengte lipiden.

De verzameling mesenterium maakt het aldus mogelijk de beoordeling van het transport van lipoproteïnen en bijbehorende onderdelen (lipiden, lipofiele moleculen, apo-eiwitten) uit de darm. De lipoproteïnen kan worden gekwantificeerd en gekarakteriseerd met als voordeel dat het mesenterium lipoproteïnen in het algemeen in een nascent staat aangezien ze niet uitgebreid door systemische enzymen gemodificeerd zoals lipoproteïne lipase ^15. Terwijl de mesenteriale lymfeklieren model gecannuleerd rat is misschien historisch gezien het meest uitgebreid beschreven voor de analyse van lipiden / lipoproteïne transport vanuit de darm, een gebied van de uitbreiding van belang is de rol van lymfevaten bij het ​​transport van lipofiele geneesmiddelen, pro-drugs en ​​andere lichaamsvreemde stoffen ^13,16 dat de focus van de hier beschreven model. Lipofiele geneesmiddelen (over het algemeen mensen met een log P> 5 en oplosbaarheid in lange-keten triglyceriden> 50 mg / g, hoewel uitzonderingen zijn schijnbare) ^17,18, prodrugs ¹⁹ en andere lichaamsvreemde stoffen ^13,16 kan de toegang tot de intestinale lymfevaten ofwel passief of door te krijgen actief te integreren in intestinale lipoproteïne transportroutes ^19.

De rat mesenteriale lymfe canulatie techniek heeft dus vele toepassingen. Bollman et al. Beschreef een eerste techniqUE het mesenterium kanaal bij ratten canule in 1948 ^20. Sindsdien is een aantal variaties op het model beschreven. Zo kan verzamelen optreden wanneer de rat wordt verdoofd met verschillende anesthetica ^21,22 of in de bewustzijnstoestand terwijl tegengehouden ¹⁵ of vrij bewegende ^23,24. Ratten worden toegediend verschillende rehydratatie oplossingen en andere stoffen zoals lipiden en geneesmiddelformuleringen met verschillende snelheden in de maag, darm of parenteraal (gewoonlijk 0-5 ml / h) ^25. In sommige studies de thoracale lymfklieren kanaal plaats mesenterium duet canule te schatten transport van de darm via de lymfevaten hoewel dit doorvoer kunnen overschatten van de dunne darm, afhankelijk van de factor van belang, zoals de thoracale lymfe kanaal ontvangt ook lymfe uit andere regio ^22,26. Lymfe canule modellen zijn ook beschreven in verschillende andere soorten waaronder muizen ^15,27, mini-pigs ^{12, 28,29} schapen, varkens ³⁰ en ³¹ honden. De ratmodel is het meest consistent en geciteerd. Gedetailleerde protocollen voor canulatie van de mesenteriale lymfe kanaal gevolgd door verzameling van lymfe in het bewuste ²⁵ of verdoofd ²² ratten en muizen ^15,27 zijn eerder gepubliceerd en de geïnteresseerde lezer wordt doorverwezen naar deze protocollen. Dit protocol is de eerste om de techniek in een gevisualiseerde formaat tonen.

De lymfe gecanuleerde rat model heeft voordelen ten opzichte van grotere diermodellen in termen van kosten, het gemak van de operatie en ethische overwegingen. In vergelijking met het muismodel, mesenterium canulatie chirurgie is ook makkelijker in de rat hoewel het muismodel kunnen meer gedetailleerde studies in transgene dieren ^27. Toch zijn er enkele beperkingen van de rat model, met name die geassocieerd met verschillen in fysiologie, deze grens extrapolation andere preklinische en klinische situaties. Bijvoorbeeld, in de rat galstroom is constant en onafhankelijk van de voedselinname, terwijl hogere soorten voedsel of lipiden stimuleert galstroom ^32. Dit creëert uitdagingen verkrijgen representatief pre- en postprandiale omgevingen ratten die weerspiegelen wat wordt gezien in grotere soorten en mensen. Voor drug delivery studies, kunnen grotere soorten ook de voorkeur bij de beoordeling van lymfatische transport na de toediening van realistische menselijke toedieningsvormen ^25. In een recente studie, werden lipiden transportsnelheden in de mesenterische lymfklieren vond vergelijkbaar tussen soorten (muis, rat, hond) na toediening van een equivalente massa en type lipide die enig vertrouwen extrapoleren lipide datatransport tussen soorten ²⁷ verschaft zijn. Echter, het vervoer van een model lipofiel geneesmiddel, halofantrine, gerangschikt in de orde van grootte van dieren (dwz, hond> rat> muis). Een schaalfactor kan dus nodig zijn om extrapolate lymfatische gegevens drug vervoer van rat naar andere soorten.

Een beperking van lymfe cannulatie modellen, in het algemeen, dat passieve lymfe rechtstreeks vanaf een lymfevat kan lymfestroom en transport niet, omdat lymfevaten tegen een drukgradiënt die wordt veranderd wanneer het vaartuig canule ³³ werken. De lymfe canulatie model kan ook moeilijk zijn om vast te stellen in laboratoria die niet vertrouwd zijn met de techniek zijn. Alternatieve modellen zijn derhalve beschreven. Bijvoorbeeld, de doorvoer factoren via de intestinale lymfestelsel, zoals lipoproteïnen en lipofiele moleculen is indirect onderzocht door bloedafname. Een dergelijk model vergelijkt men bloedconcentraties van lipiden en / of geneesmiddelen na orale toediening in aanwezigheid en afwezigheid van remmers (bijvoorbeeld colchicine, Pluronic L81, cycloheximide) van intestinale lipoproteïne productie die lymfatisch transport ³⁴ blokkeren. Een voordeelvan modellen die lymfatische transport kwantificeren indirect via de bloedafname is dat het in staat stelt een aantal evaluatie van lymfatische vervoer bij de mens als invasieve chirurgie niet nodig is ^35. Echter, remmers van lymfatisch transport niet specifiek en factoren die via de lymfevaten getransporteerd worden verdund en gewijzigd in de systemische circulatie met dergelijke beoordelingen compliceert. In vitro alternatieven zijn ook beschreven. Bijvoorbeeld zijn Caco-2 cellen of geïsoleerde enterocyten culturen gebruikt bestuderen in meer detail de intestinale secretie van moleculen die de lymfevaten ^36-38 voeren. Een geavanceerde in vitro model dat meer representatief voor de humane intestinale micro werd recent beschreven ^39. In dit model een lymfatische endotheliale cellaag samen gekweekt met Caco-2-cellen die meer gedetailleerde analyse van de overdracht van stoffen uit de darm naar de lymfevaten mogelijk maakt. In vitro cel systemen ontbreekt uitwisseling flow en overdragen dwz interconnectie met een intestinale lumen en de onderliggende bloed en lymfatische vasculaire aanbod. In een alternatieve benadering, Kassis et al. Werd een dual-channel (high-speed bright-field video en fluorescentie) in situ imaging systeem dat kwantitatieve vergelijkingen tussen vaartuig contractie, lymfestroom en fluorescerende lipide concentraties in mesenteriale lymfevaten ³³ mogelijk maakt. Een voordeel van dit model op de bovengenoemde in vitro systemen is dat daardoor nauwkeurig volgen van de doorgang van immuuncellen door de lymfevaten. Absolute metingen van massa lipide (of drugs) vervoer zijn echter nog niet vastgesteld met behulp van beeldvormende technieken. In vitro en in silico benaderingen om specifiek te voorspellen de mate van lipofiele vervoer geneesmiddel via de intestinale lymfevaten zijn ook gepubliceerd ^40-42. Bijvoorbeeld, de ex vivo affiniteit van verschillende compounds voor plasma chylomicronen bleek redelijk goed te correleren met hun lymfatische transport in vivo ^41. Vervolgens dezelfde groep opgericht een in silico model om drug affiniteit voorspellen voor chylomicronen op basis van meerdere fysisch-chemische eigenschappen ^40. Holm et al. Stelde ook relatief complex in silico model regelrechte voorspellen lymfatisch transport van lipofiele verbindingen op basis van moleculaire descriptoren ^42. Deze modellen kunnen een nuttige benadering voor de omvang van lymfatisch transport van onbekende geneesmiddelen voorspellen verschaffen. Validatie van de modellen met een breed scala van drugs en over verschillende labo's zullen echter worden verplicht hun nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te bevestigen.

Canulering van de mesenterische lymfklieren kanaal blijft dus de enige manier om de inhoud van lymfe aftappen van de dunne darm en de doorvoer snelheid van de complexe reeks factoren (cellen, eiwitten direct onderzoekenpeptiden, lipiden, drugs) in lymfe in een in vivo situatie. Hierin beschrijven we een protocol voor canulatie van de mesenteriale lymfe duct en halsslagader dat het verzamelen van mesenteriale lymfe en systemische bloed van verdoofd ratten maakt. Representatieve gegevens tonen hoe het model kan worden gebruikt om lipide en geneesmiddel transport van de darm te onderzoeken via de mesenteriale lymfestelsel. Dit wordt gevolgd door een bespreking van problemen die kunnen worden ondervonden bij het vaststellen van het model en een gids voor probleemoplossing. Eenmaal gevestigd het model is een krachtig hulpmiddel om intestinale lymfatische vervoer te onderzoeken.