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의학

Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen

Published: March 10, 2015
doi:
10.3791/52383
, ,
1The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, 2The Department of Medical Biology,University of Melbourne, 3Olivia Newton-John Cancer Research Institute

Summary

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Abstract

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

Introduction

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist die 4. häufigste Ursache von malignen Erkrankungen weltweit 1. Trotz der erheblichen Fortschritte in unserem Verständnis der familiären Basis dieser Krankheiten dienen, trägt genetische Veranlagung nur ~ 20% der Fälle 2 CRC. Der Rest sind zahlreichen extrinsische und Umgebungsfaktoren, einschließlich chronische Entzündung zurückzuführen. Beim Menschen ist die Verbindung zwischen einer chronischen Entzündung und Darmkrebs evident bei Colitis ulcerosa (UC) der Patienten, die ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Colitis assoziierte Darmkrebs (CAC) aufweisen, abhängig von der Dauer, des Ausmaßes und der Schwere der entzündlichen Erkrankung 3 -5. Dementsprechend sind neue Therapien in Entwicklung, um die Immunantwort und das zugehörige Herstellungs von Wachstumsfaktoren durch die entzündliche Tumor-Mikro 6-8 steuern. Es besteht ein zunehmender Bedarf an geeigneten präklinischen Tiermodellen, um die therapeutische Wirksamkeit zu charakterisierendiese Medikamente gegen die Entwicklung und das Fortschreiten der Krankheit.

Mausmodelle haben eindeutig gezeigt, dass der Entzündungsmikro trägt zur CRC Progression, auch in Abwesenheit von offener Entzündung 9,10. Diese Modelle umfassen die Verwendung des Polysaccharid Dextransulfat-Natrium (DSS), in das Trinkwasser der Mäuse bereitgestellt, epitheliale Verletzungen und akuten und chronischen entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) 11,12 modellieren. Obwohl der Mechanismus, durch den DSS induziert Schleimhautschädigung und Colitis ist nicht vollständig verstanden, legen einige Studien nahe, dass DSS hemmt Zell reverse Transkriptase und Ribonuclease-Aktivitäten in den Zellen, oder die Bildung von Nano-Lipid-Komplexe, die mit der Kolon-Membran führt zu Schäden epithelialen verschmelzen 13,14. Änderungen an der Standard-DSS-Modell wurden auch wichtige Einblicke in die vorgesehenen Mechanismen, durch die Kolonepithelzellen halten Gewebshomöostase und OrdnungsmäßigkeitEnde Schleimhautimmunreaktion 15.

Intraperitoneale Verabreichung von Azoxymethan (AOM) allein oder in Kombination mit DSS, ein Modell für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen somatische Mutationen in der epithelialen Schleimhaut und der inflammatorischen und stromale Mikroumgebung 16,17. AOM ist ein Metabolit des Karzinogen 1,2-Dimethylhydrazin (DMH), die nicht direkt in DNA-Mutationen führen. Stattdessen ist AOM hydrolysiert durch das Cytochrom-Isoform CYP2E1 in die Leber, wo MAM wird mit Glukuronsäure konjugiert und dann an den Darm durch Gallensekreten 18 transportiert methylazoxymethanol (MAM). Es wird vermutet, dass die bakterielle β-Glucuronidase trägt zum Abbau von MAM was zu DNA-Alkylierung und die Akkumulation von Mutationen in Epithelzellen 19. Meist AOM-induzierten Kolontumoren beherbergen Missense-Mutationen im Gen für β-Catenin, wodurch das Protein resistent gegen proteasomalen degradatiauf, die aberrante Aktivierung des Wnt-Signalwegs 20 zur Folge hat. Wenn die Aktivität des AOM ist mit der Schleimhautschädigung durch DSS ausgelöst kombiniert, die darauf folgende Wundheilungsreaktion erzeugt eine Mikroumgebung, die für das Wachstum und die Expansion der mutagenisierten Epithel ist. In einer Variation dieses Modells können wiederholte Gabe AOM allein über einen Zeitraum von mehreren Wochen modelliert werden sporadischen kolorektalen Krebs, in der Abwesenheit von DSS-induzierten Colitis 10,17. Diese beiden Modelle bieten kostenlose experimentellen Einstellungen CAC und sporadischen CRC bzw. studieren, die beide mit einem pro-inflammatorischen Tumor-Mikroumgebung 10 assoziiert.

Die Verwendung von Serien Endoskopie bei Mäusen wurde von Becker und Kollegen 21 Pionierarbeit und ermöglicht Längs Überwachung von Colitis und Tumorprogression. Hier bieten wir Ihnen drei präklinischen Protokolle basierend auf DSS-induzierte Schädigung der Schleimhaut und / oder AOM-vermittelte tumor Induktion reproduzierbar induziert spezifische Darmerkrankungen. Das erste Protokoll beschreibt induziert akute Schädigung der Schleimhaut in Reaktion auf DSS Verwaltung, viele der histopathologischen Merkmalen mit CED assoziiert zu entlocken. Das zweite Protokoll wird an drei aufeinanderfolgenden Zyklen von DSS Verwaltung basierend auf die Fackeln Entzündungs ​​üblicherweise in IBD-Patienten beobachtet imitieren und kann in Verbindung mit AOM-induzierten Mutationen durchgeführt werden. Die endgültige Protokoll basiert auf AOM-induzierten epithelialen sporadische Mutationen basiert. Für jedes dieser Protokolle, die wir auf die entsprechenden Standardverfahren zu erweitern, um prophylaktische und therapeutische Interventionsmethoden, die wir entwickelt haben, um die Wirksamkeit von neuen Arzneimitteln zu überwachen sind.

Protocol

Die Walter und Eliza Hall-Institut für medizinische Forschung Tierethikkommission genehmigt jeder der in diesen Protokollen beschriebenen Verfahren. 1. Vorbereitung der experimentellen Mäuse Verfassen experimentellen Kohorten von mindestens 4 Geschlecht abgestimmt 6-8 Wochen alte C57BL / 6 Mäuse (M. musculus), die gezüchtet und in der gleichen spezifischen pathogenfreien (SPF) Tierhaltung / Zimmer untergebracht sind und mit autoklaviertem Nahrung und Wasser versorgt. Die Verwendung von weiblichen Mäusen wird co-Gehäuse von Mäusen aus verschiedenen Linien, Grenz Box-Nummern zu ermöglichen und zu reduzieren Käfig zu Käfig Variation. Stellen Sie sicher, dass Mäuse, sind mindestens 6 Wochen alt sein, um die Endoskopie zur Verwendung des 3,0 mm Durchmesser Endoskopie Mantel zu ermöglichen. Verwenden Sie Mäusen des gleichen genetischen Hintergrund und, wo möglich, aus den Käfigen auf dem gleichen Rack Variationen mit der Darmflora zu reduzieren gespeichert. Variationen in Mikroflora zwischen Tieranlagen sollte in Betracht whe genommen werdenn Bestimmung der geeigneten Kontrollmäusen und Genotypen für jedes Experiment 22. Mark Mäusen durch Ohr / toe Ausschnitte, Tattoos, oder ähnlich wie für eine einfache Identifizierung ermöglichen. Wiegen Mäusen am Tag 0, zum Ausgangs experimentellen Gewichte bestimmen. Führen Endoskopie (siehe Abschnitt 5) von Mäusen am Tag 0 zum Ausgangswert Kolon Phänotypen aufzuzeichnen. 2. Präklinische Studie in einer Epithelschädigung und akute Colitis Modell Es wird eine Lösung des therapeutischen Mittels zu testen. Für Therapeutika durch orale Gabe (po) geliefert werden, werden die Lösungen auf ein Maximalvolumen von 100 ul. Für Therapeutika durch intraperitoneale (ip) Injektion verabreicht, werden die Lösungen zu einem maximalen Volumen von 200 ul. HINWEIS: Wiederholter ip oder po Verabreichung des Arzneimittels über längere Zeit kann zu veränderten Mausverhalten führen. Wechselt die IP-Injektionsstelle auf längere Beschwerden zu vermeiden. Für po Applikation bieten die Mäuse mit autoLlaved Sonnenblumenkerne als "behandeln" die negativen Zusammenhang mit der Magensonde Verfahren zu minimieren. Am Tag 1 verwalten die therapeutische von Interesse (in Schritt 2.1 vorbereitet) und eine geeignete Fahrzeugsteuerungen. In dem Beispiel vorgesehen (6A), 5 ug des rekombinanten humanen (rh) iInterleukin (IL) -11-Protein wurde in 200 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und ip Bestimmen Sie den Zeitpunkt und die Häufigkeit der Verwaltungen, die in Abhängigkeit von der pharmakokinetischen Profils des therapeutischen Reagenz, das getestet wird aufgebaut sein wird. Abbildung 1 entnommen prophylaktische Behandlung mit zweimal täglich ip Injektionen im Laufe des Experiments. Überwachen Sie, einschließlich Stuhlkonsistenz und das Vorhandensein von Blut, und wiegen jede Maus täglich. An den Tagen nach der Behandlung mit einem Gewicht sollte mit der Verabreichung des therapeutischen Arzneimittels übereinstimmen, um Stress für die Mäuse durch wiederholte Handhabung zu minimieren. </li> An Tag 3 wurden vorbereitet 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS-Lösung im Trinkwasser routinemßig den Mäusen durch die Tiereinrichtung vorgesehen. Etwa 5 ml / Maus / Tag von DSS-Lösung wird für das Experiment erforderlich ist. Der Verbrauch des DSS Wasser kann sich ändern, wenn die Umgebungstemperatur der Tieranlage schwankt. HINWEIS: DSS ist ein Reizmittel und sollten gemäß dem MSDS Anweisungen behandelt werden. Für Frisch DSS an die Mäuse ad libitum in Reinwasserflaschen für 5 aufeinander folgenden Tagen. Am Abend des 5. Tag bieten normales Trinkwasser neben püriert Futterpellets und Proteinergänzung in kleinen Petrischalen (100 g Futterpellets / 10 g Protein-Shake / 10 ml Wasser) zur Verfügung gestellt. Dies verhindert das Austrocknen und hilft bei der Minimierung der schweren Gewichtsverlust. Euthanize Mäuse durch CO 2 Rausch und sammelt Gewebe die anschließende histologische Untersuchung am Morgen des Tages 8, oder wenn die Mäuse auftreten ≥15% Gewichtsverlust von mehr als drei Consecutive Tage, je nachdem, was zuerst eintritt. HINWEIS: Stellen Sie die DSS-Dosis zwischen 1-4% (w / v) in Abhängigkeit von der Mikroflora der Tierhaltung und der Charge des DSS. Führen Sie Routinechargenprüfung, um die geeignete Dosierung und DSS umgehen Charge zu Charge Schwankungen zu etablieren. Die geeignete Dosierung hängt von Gewichtsverlust (von nicht mehr als 15% des ursprünglichen Gewichts) bezogen und bestätigt ulcerosa Histopathologie. 3. Präklinische Testversion in eine chronische Kolitis oder Colitis-assoziierten Cancer Für die chronische Kolitis Modell beginnen mit Schritt 3.7. Für die Colitis-assoziierten Krebs (CAC) Modell, an Tag 1, injizieren jede Maus mit 10 mg / kg (w / w) Azoxymethan (AOM, 250 ul, ip). HINWEIS: AOM ist krebserregend und sollten gemäß dem MSDS Anweisungen behandelt werden. Stammlösungen von AOM als 10 mg / ml-Aliquoten hergestellt und bei -20ºC gelagert. Am Tag der Injektion wird die AOM-Stammlösung aufgetaut und auf 1 mg / m verdünntenl in PBS. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen des AOM Stammlösung sollte vermieden werden. Der AOM Dosis von 8-12 mg / kg eingestellt werden. Routine Chargenprüfung ist erforderlich, um die geeignete Dosierung AOM, um die Toxizität für Mäuse aufgrund von Charge zu Charge Variation umgehen herzustellen. Während der Tage 1-7 folgende AOM Verwaltung Gewichte stabil sein wird und aus diesem Grund Gewichtsüberwachung kann bei Tage 1-7 weggelassen werden, um mit den Tieren, die zytotoxische Metabolite in ihrem Kot ausscheiden wird vermieden. Am 7. Tag alle Betten geändert werden muss nach einer zytotoxischen Verfahren. Sobald der Betten Änderung abgeschlossen ist, werden die Tiere nicht mehr benötigen zytotoxische Behandlungsprozeduren, da sie nicht mehr sein Ausscheiden zytotoxische Metaboliten. Am 8. Tag, bereiten 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS-Lösung (wie in Schritt 2.5 beschrieben) und bieten den Mäusen ad libitum. Wiegen Mäuse täglich während des gesamten Experiments und auf Zeichen von Krankheit, einschließlich gekräuselten fur, gebeugt, Blut im Stuhl und reduzierte Bewegung. Am Tag 13, nehmen Sie die DSS-Lösung und stellen die Mäuse mit normalem Trinkwasser bis Tag 28. Tage 8-28 bilden eine "Zyklus" der chronische Kolitis / CAC-Protokoll. An den Tagen 13 bis 28, wenn die Mäuse normales Trinkwasser gegeben, stellen die Mäuse mit gestampften Futterpellets und eine Proteinergänzung in kleinen Petrischalen (100 g Futterpellets / 10 g Protein-Shake / 10 ml Wasser) zur Verfügung gestellt. Dies verhindert das Austrocknen und hilft bei der Minimierung der schweren Gewichtsverlust. HINWEIS: Die Proteinergänzungen in Maische nicht zur Verfügung gestellt werden, wenn die Mäuse erhalten DSS haltigen Trinkwasser, um die Konsistenz in DSS Verbrauch zu gewährleisten. An Tag 20 führen die zweite endoskopische Untersuchung, einzelne Maus Gesundheit zu überwachen (siehe Abschnitt 5). An Tag 29 Wiederholung der DSS-Zyklus (Zyklus 2: 2,5% (w / v) DSS während der Tage 29 bis 33 und normales Trinkwasser während der Tage 34 bis 50 zur Verfügung gestellt). An Tag 40 führen die third endoskopische Untersuchung, einzelne Maus Gesundheit zu überwachen und festzustellen, Tumorlast (siehe Abschnitt 5). Wenn keine Tumore sichtbar sind durch Endoskopie an Tag 40, beginnt eine dritte DSS Zyklus an den Tagen 50-72 (Zyklus 3: 2,5% (w / v) DSS während der Tage 50-55 und normales Trinkwasser während der Tage 56-72 gestellt). Im Allgemeinen sind Tumoren bis zum Tag 40 sichtbar und daher in den dritten Zyklus DSS kann entfallen. Sobald Tumoren werden durch endoskopische Untersuchung sichtbar, weisen Sie jeder Maus eine endoskopische Tumor Score (siehe Abschnitt 5) und weisen Sie einzelnen Mäusen zu Kohorten mit ähnlichen Ausgangstumorbelastungen. An Tag 42 (oder bei Tumoren sind sichtbar), die Verwaltung der therapeutischen Verbindung oder relevante Fahrzeugsteuerung (siehe Abschnitt 2.2). Das Timing der Dosierung wird abhängig von der Pharmakokinetik der therapeutisch. Ein Beispiel für einen Eingriff Behandlung ip injiziert dreimal wöchentlich in Mäusen mit etablierten Tumoren vorgesehen ist (Figur 2). Führen Sie endoscopic Prüfungen einmal wöchentlich über die Dauer der therapeutischen Behandlung zu überwachen Tumorlast. Im Allgemeinen ist von 4 Wochen nach einer therapeutischen Behandlung ausreichend, um ein objektives Ansprechen auf die Behandlung zu beobachten. Nach Beendigung der Behandlung wird eine Gruppe von Mäusen kann auch durch Endoskopie zur Tumorrückfall beobachtet werden. Euthanize Mäuse durch CO 2 Rausch und sammeln Gewebe für biochemische und / oder histologische Analyse am Morgen des Tag 72 oder, wenn Mäuse erleben ≥15% Gewichtsverlust von mehr als drei aufeinander folgenden Tagen, je nachdem, was zuerst eintritt. 4. Präklinische Testversion in eine sporadische Darmkrebs-Modell Am Tag 1 injizieren jede Maus ip mit 10 mg / kg AOM (siehe Schritt 3.2). Der AOM Dosis von 8-12 mg / kg eingestellt werden. Routine Chargenprüfung ist erforderlich, um die geeignete Dosierung AOM, um die Toxizität für Mäuse aufgrund von Charge zu Charge Variation umgehen herzustellen. Ist die Einspritzung am ersten Tag jeder Wochefür die folgenden 5 Wochen (Abbildung 3). Die Mäuse sollten entsprechend zytotoxischen Sicherheitsverfahren für den gesamten 6 Wochen behandelt. Wiegen Sie jede Maus am Tag der AOM Injektion, dass Ängste auf die Mäuse durch wiederholte Handhabung zu minimieren. HINWEIS: AOM ist krebserregend und sollten gemäß dem MSDS Anweisungen behandelt werden. Alle Tiere sollten nach zytotoxischen Sicherheitsverfahren für die 6 Wochen AOM ip Injektionen für dieses Protokoll erforderlich behandelt werden. Während der Woche 8 endoskopische Untersuchung für neue Tumoren (siehe Abschnitt 5) zu überwachen. Die endoskopische Untersuchung durchgeführt werden sollte alle zwei Wochen, bis Tumore sichtbar werden. Im Allgemeinen beginnen Wildtyp C57BL / 6 Tieren Tumore um ca. 40 Wochen nach der ersten Verabreichung von AOM zu entwickeln. Sobald Tumoren werden durch endoskopische Untersuchung sichtbar, eine endoskopische Tumor Punktzahl weisen Sie jeder Maus (siehe Abschnitt 5) und weisen Sie einzelnen Mäusen zu einer Kohorte mit ähnlichen Tumorbelastung vor dem Beginn der therapeutischen Behandlung. Während der Woche 40 (oder bei Tumoren sind erste sichtbare), zur Verwaltung der therapeutischen Verbindung oder die entsprechende Fahrzeugsteuerung. Das Timing der Dosierung wird abhängig von der Pharmakokinetik der therapeutisch sein (siehe Schritt 2.1). Ein Beispiel für einen Eingriff Behandlung ip injiziert 3mal wöchentlich in Mäusen mit etablierten Tumoren vorgesehen ist (Figur 3). Endoskopische Untersuchung wöchentlich für die Dauer der therapeutischen Behandlung Perioden Tumorbelastung zu überwachen. Im Allgemeinen ist von 4 Wochen nach einer therapeutischen Behandlung ausreichend für eine objektive Ansprechen auf die Behandlung. Nach Absetzen der Behandlung, eine Gruppe von Mäusen können auch durch Endoskopie zur Tumorrückfall überwacht werden. Euthanize Mäuse durch CO 2 Rausch und sammeln Gewebe für biochemische und / oder histologische Analyse des Dickdarms und Tumore in Woche 45, oder nach 4 Wochen der Therapie. ve_title "> 5. Endoskopische Untersuchungen Die Endoskopiegeräte sollten nach Standardverfahren 16 zusammengebaut werden. Sterilisieren und Reinigen der Endoskopsonde mit 70% Ethanol oder einem antibakteriellen Gleitmittel. Videos können mit einem Laptop oder Desktop-Computer und Standard-Media-Software, wie iMovie aufgezeichnet werden. Ein Standard-Computer-Monitor, anstatt ein Monitor medizinischer Qualität, ist ausreichend, um den Darm während der Endoskopieverfahren (Figur 4) zu visualisieren. Anesthetize Gruppen von 5-6 Mäusen gleichzeitig in einer Kammer mit 3% Isofluran in 100% O 2 bei einer Rate von 0,2-0,4 l / min. Nachdem die Mäuse anästhesiert, die vom Zehenklemm bestätigt wird; die Isofluran Ebenen sollten auf 0,5-2% für die Wartung geändert werden. Entfernen Sie eine individuelle Maus aus der Kammer, und legen Sie sie Bauchseite nach oben mit dem Kopf in einem Nasenkegel gesichert. Vollnarkose sollte überwacht werden, und die Hinterbeine sollte so eingestellt werden, dass sie shinter der Maus tretched. Legen Sie einen Tierarzt Salbe auf die Augen der Mäuse bis zur Trockenheit zu verhindern. Halten Sie den Schwanz der Maus, wo es die untere Wirbelsäule trifft zu zeigen deutlich den Anus. Legen Sie die starren Endoskophülle in ein Becherglas mit Wasser und stellen Sie den Luftstrom um die Freilassung einer kleinen Luftblase in einer Zeit zu ermöglichen. Der Luftstrom wird der Doppelpunkt erlauben, sich aufzublasen. Wenn der Luftstrom zu stark ist, wird Luft in den Magen der Maus gepumpt werden. Keine zusätzliche Schmierung erforderlich. Die starre Endoskophülle in den Mastdarm vorsichtig. Im allgemeinen kann das Endoskop bis zu 3 cm, an welchem ​​Punkt der Doppelpunkt in Mäusen Kurven und nicht zugänglich ist starren Endoskops eingeführt werden kann. Eine häufige Schwierigkeit während der Endoskopie Verfahren ist Sperrung des Zugangs zu dem Lumen des Kolons durch Fäkalien. Vermeiden Sie dies, indem sanft massiert dem Bauch der Mäuse vor dem Eingriff, um Stuhlgang zu fördern, oder vorsichtig manövrieren des Endoskops um die Fecal Sache während des Verfahrens. Peristaltik kann auch auftreten, während der das Endoskop sollte in Position gehalten werden, bis das Colon Muskulatur relaxiert. Initiieren Videoaufzeichnung in jedem Stadium des Endoskopieverfahren. Disease Scoring können von einem erfahrenen Assistenten während des Verfahrens aufgezeichnet werden, oder zu einem späteren Zeitpunkt aus den Videodateien. Nach der endoskopischen Untersuchung, geben die Mäuse in ihren Käfig und während der Erholung aus der Narkose zu überwachen. Tiere sind in der Regel wach und mobil innerhalb von 2 Minuten nach der Entnahme aus dem Isofluran verabreicht Nasenkegel. Stellen Sie sicher, dass diese Verfahren werden von einem erfahrenen Wissenschaftler durchgeführt. Jedes Endoskopie Verfahren dauert etwa 2 Minuten pro Maus zu nehmen. 6. Krankheits Scoring Um ulcerosa überwachen, Score Videos zur Murine Endoskopische Index von Colitis Severity (MEICS) 16, die Veränderungen in der (i) dokumentiert die Dicke der Darmwand durch Transparenz gekennzeichnet, (Ii) Stuhlkonsistenz, (iii) Blutgefäß Integrität und Präsenz, (iv) Geschwüre und Bereiche der Regeneration, die in ein kompakter Form zu präsentieren, (v) Blutungen durch Fibrinablagerungen (5a) angezeigt. Um Tumorlast zu überwachen, Score Videos für Tumorinzidenz und Größe. Die Tumorgröße wird durch den Durchmesser der Darmlumen durch den Tumor 16 (Figur 5b) besetzt bestimmt. Es ist üblich, beide ulcerosa und Tumor-Scoring-Parameter für eine einzelne Maus. Mit Endoskopie, einzelne Tumoren und die Gesundheit der Darmschleimhaut kann über längere Zeit beobachtet werden, was ein Auslesen für den Erfolg neuer Therapeutika bei einem Tier. (Optional) Standbilder können von den Videos zur Erzeugung von repräsentativen Zahlen (Abbildung 6) extrahiert werden.

Representative Results

Gewichtsverlust wird als Standard-Parameter verwendet werden, um für die Krankheit mit Colitis, die routinemäßig verwendet wird, um die allgemeine Gesundheit der Mäuse Monitor verbunden überwachen. Tiere in der Regel ihr Gewicht zu halten, während DSS haltiges Wasser verabreicht wird und nur Gewicht verlieren beginnen, wenn sie in den normalen Trinkwasser zurück. Akzeptabel Gewichtsverlust Parameter sollten gemäß dem Tierethikkommission der Institution etabliert werden. Um die Dehydrierung bei längerem Durchfall zu vermeiden, sollte die routinemäßige Bestimmung der Maische (Futterpellets püriert und mit Trinkwasser) mit einem Protein-Shake zusätzlich zu den normalen Trinkwasser ergänzt. Als Alternative Anästhesie Ketamin / Xylazin oder ähnliche Mittel verwendet werden können, ist, wenn Isofluran Ausrüstung nicht verfügbar ist. Durch die starre Beschaffenheit des Endoskops nur diese Vorgehensweise ermöglicht eine Visualisierung der distalste 3 cm des Mausdickdarm. Neuere Endoskope mit zusätzliche Funktionen (einschließlich Flexibilität und Fluoreszenz) sind je nach den Bedürfnissen des Experiments. Da jedoch die nachteiligen Wirkungen von DSS sind überwiegend dem distalen Colon von Mäusen, mit in der Mitte Kolon beobachtet milder Pathologie beschränkt, das starre Endoskop nicht Überwachung der Schleimhaut Gesundheit der einzelnen Mäusen hemmen. Obwohl wir ein Protokoll für die prophylaktische Behandlung von akuten DSS-induzierter Kolitis zu beschreiben, kann dieses Protokoll einfach geändert werden, um Interventionen Behandlungsstrategien zu testen. Die Wirksamkeit eines Medikaments zur Epithelschädigung und Colitis lindern kann in Längsrichtung in einzelne Mäuse beobachtet und auf Basis der beschriebenen Scoring Parameter (Abbildung 5) quantifiziert werden. Dies ist gegenüber herkömmlichen experimentellen Designs, das Culling von Mäusen zu bestimmten Zeitpunkten während des Versuchsprotokoll erfordern, vorteilhaft und ermöglicht nicht die Charakterisierung der Erkrankung als Antwort auf eine Behandlung mit der Zeit. t "> Klinische Studien am Menschen haben eine beträchtliche Variabilität in verschiedenen Tumoren wie bei einem individuellen Patienten auf Behandlungen ansprechen hervorgehoben. Die Verfahren, die hier beschrieben werden, sind ein Mittel, um die Gesamttumorlast sowie das Ansprechen auf die Behandlung einzelner Tumorverlauf zu überwachen eines Experiments. Es ist wichtig zu beachten, dass die Interventions Protokolle, die für die Krebsmodellen umrissen sind, nicht berücksichtigt die Effekte einer Therapie auf Tumorinitiation zu nehmen. Die prophylaktische Protokolle, mit der Behandlung vorgesehen vor, wenn die Tumore endoskopisch sichtbar werden, sind erforderlich, um diese Informationen zu erhalten. Die hier beschriebenen Protokolle liefern Informationen über die therapeutische Wirkung auf die auf das Fortschreiten (gemessen durch die Tumorgröße) der einzelnen Tumoren. Tumorregression kann auch durch eine Reduzierung der Anzahl der sichtbaren Tumore anzugeben. g "/> Abb. 1: Die Überwachung der Wirksamkeit einer prophylaktischen Behandlung Therapie in einem Modell der akuten Darmschäden Das experimentelle Protokoll (a) erfordert 8 Tage von Anfang bis Ende. Therapeutics werden von Tag 1 für prophylaktische Behandlungen verabreicht (b). DSS im Trinkwasser (c) von Tag 3 des Versuchsprotokoll bereitgestellt. Endoskopie durchgeführt wird (d), um das Fortschreiten der Krankheit bei den Tieren zu überwachen. Empfohlener Zeitpunkten umfassen Tag 0 (unbehandelt) und Tag 2 (Health Monitoring), Tag 5 und 8 (zu Krankheitslast bestimmen). Das Experiment wird beendet (e) am Morgen des 8. Tag: In einer Wildtyp-Maus (f) das Fortschreiten der Krankheit mit der Zeit zunimmt. Abbildung 2: Überwachung der Wirksamkeit der Intervention Therapie in einem Modell of ulcerosa-assoziierten Krebs. Das experimentelle Protokoll (a) ist 72 Tage vom Beginn bis zum Abschluss. Therapeutics (b) an Mäuse mit etablierten Tumoren von Tag 46 für eine Intervention Behandlungen verabreicht. AOM (c) wird am Tag 1 injiziert, und DSS im Trinkwasser über einen Zeitraum von drei Zyklen des experimentellen Protokolls bereitgestellt, beginnend am 8. Tag Endoskopie (d) durchgeführt wird, um das Fortschreiten der Krankheit bei den Tieren zu überwachen. Empfohlener Zeitpunkten umfassen Tag 0 (unbehandelt), Tag 20 (Gesundheitsüberwachung) und Tag 40 (nach Gruppen Tiere nach Tumorlast). Endoskopie wird wöchentlich im Laufe der therapeutischen Behandlung durchgeführt, um Krankheitsverläufe zu überwachen. Das Experiment (e) am Morgen des 72. Tag beendet In einer Wildtyp-Maus (f) Tumorbelastung steigt von Tag 40 ab. <img alt="Figur 3"src = "/ files / ftp_upload / 52.383 / 52383fig3highres.jpg" /> Abb. 3: Die Überwachung der Wirksamkeit der Intervention Therapie in einem Modell der spontanen Darmkrebs Das experimentelle Protokoll (a) benötigt> 50 Wochen von Anfang bis Ende. Therapeutics (b) an Mäuse mit etablierten Tumoren Interventions Behandlungen verabreicht. AOM (c) wird am Tag 1 über den Verlauf der experimentellen Protokoll injiziert und danach wöchentlich für 6 aufeinanderfolgenden Einspritzungen. Endoskopie (d) durchgeführt wird, um das Fortschreiten der Krankheit bei den Tieren zu überwachen. Empfohlener Zeitpunkten umfassen Tag 0 (unbehandelt) und Woche 8 (Tumorüberwachung) und alle zwei Wochen gibt es nach (auf Tumorlast zu schaffen). Endoskopie wird wöchentlich im Laufe der Behandlung, um therapeutische Ergebnisse zu überwachen geführt. Das Experiment (e) in Woche 50 beendet in einer Wildtyp-Maus (f) Tumorbelastung steigt von Woche 40 ab. </p> Abb. 4: Geräteaufbau Der Versuchsaufbau (a) für das endoskopische Gerät, mit einzelnen Geräte angezeigt. Das starre Endoskop (b), wobei die einzelnen Bestandteile angegeben. Balken = 2,5 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abb. 5: Scoring Krankheitsparameter durch Endoskopie ist eine Grundriss (a) des Murine Endoskopische Index von Colitis Severity (MEICS). Ein Überblick (b) der einzelnen Tumor Scoring-Parameter.es / ftp_upload / 52.383 / 52383fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 6: Vertreter therapeutischen Behandlungen Vertreter Gewichtsverlust, endoskopische Bilder und Spielstände für:. (A) Akute DSS-induzierten Schäden der Schleimhaut (b) Tumoren, die im Anschluss an die AOM / DSS-Protokoll entwickelt, (c) Tumoren, die im Anschluss an die sequentielle entwickelt.. AOM-Protokoll. N = 3 Mäuse pro Gruppe. * P <0,05, *** p <0,001 (Student-T-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

Die drei Protokolle, die beschriebenen Gliederung Methoden der zuverlässigen und reproduzierbaren Induktion von Dickdarmerkrankung Pathologie in Mäusen. Wenn mit routinemäßigen endoskopischen Überwachung und die Interventionsstrategien hier skizzierten kombiniert, werden diese Protokolle bieten leistungsstarke präklinischen Einblick in die Wirksamkeit von Therapeutika. Unsere Labors routinemäßig alle diese Protokolle, um den Erfolg neuer Therapeutika 10,23,24 überwachen.

Es gibt eine Reihe von Überlegungen bei der Auswahl eines vorklinischen Tiermodell, um neue Therapeutika zu testen. Dazu zählen Relevanz des Modells auf die menschliche Krankheit, und der Beitrag der Tumor-Mikroumgebung auf die vorgeschlagene Maßnahme des therapeutischen Ziels. Hier bieten wir Ihnen drei Protokolle für die therapeutische Intervention in etablierten Darmkrankheitsmodellen. Diese Modelle sind reproduzierbar und die Lieferung von Reagenzien für Krankheiten induzieren einfach zu verwalten. Wichtig ist, dass die Modelle von großer Bedeutungmehrere Facetten und Phasen der Colitis Beginn, und der Tumor Initiierung und Progression. Forscher sollen, ist das genetische Hintergrund der Mausstämme verwendet bei der Konstruktion Experimente wie die Anfälligkeit für Krankheiten von DSS und / oder AOM induzierte kann beträchtlich variieren 25 erfolgen. Zusätzlich können verschiedene Mikrobengemeinschaften haben unterschiedliche Stoffwechselleistungen im Zusammenhang mit der AOM, die durch Bakterien metabolisiert wird. Wir warnen davor, verschiedenen Kohorten von Mäusen, die in verschiedene Tierhaltung (einschließlich kommerzielle Anbieter) in einem einzigen Experiment geboren wurden. Ähnlich kann die verschiedenen Mikroflora in Mäuse von verschiedenen Einrichtungen verwendet hervorrufen anderen Host antwortet DSS-induzierte Epithelbarriere Schaden 11. Darüber hinaus sollte die geeignete Analyse der Gewebe (zum Beispiel RNA-Reinigung) ebenfalls berücksichtigt werden, da die Fähigkeit DSS reverse Transkriptase werden in den Folge molekulare Analyse 26,27 auswirken hemmen.

<p class = "jove_content"> Maus Endoskopie ist eine Schneide-Technik zu Beginn der Erkrankung und Progression in einer individuellen Maus wiederholt zu überwachen. Die Möglichkeit, Videos aufzunehmen und zu extrahieren Standbilder ermöglicht eine einfache Überwachung mehrerer Krankheitsparameter und Tumoren. Neben der Verbesserung des Tierschutzes, reduziert endoskopische Überwachung auch die Notwendigkeit für mehrere Kohorten von Versuchsmäusen, die traditionell wurden zu verschiedenen Zeitpunkten getötet, um den Krankheitsverlauf zu verfolgen. Die MEICS Punktesystem ist kein Ersatz für eine histopathologische Analyse, sondern bietet ein alternatives Mittel für die Tiergesundheit und die Schädigung der Schleimhaut in lebenden Mäusen zu überwachen. Maus-Endoskopie ist eine spezialisierte Labortechnik, und alle Verfahren sollten von geschultem Personal durchgeführt, um geeignete Manipulation und Handhabung der Mäuse zu gewährleisten, sowie gleichbleibende Qualität in der für Krankheit Scoring verwendeten Bilder zur Verfügung zu stellen. In den Händen von qualifiziertem Personal, wir haben festgestellt, dass die Endoskopie induziert keine oder nur geringe Schäden an der tumors, die intratumorale Blutungen verursachen würde. Für die therapeutische Protokolle ausgeführt, betrachten wir Endoskopie sehr vorteilhaft, da sie einen Weg, um den anfänglichen Tumorlast zu bestimmen, und erlaubt uns, Gruppe Kohorten von Tieren mit ähnlichen Tumorbelastungen vor der Verabreichung eines therapeutischen Medikaments. Sequential Überwachung der Mäuse ermöglicht es Forschern, um die Wirksamkeit neuer Therapien frühzeitig festzustellen, mit der Möglichkeit der Beendigung erfolglosen Versuchen in einer angemessenen Zeitspanne.

Als unser Verständnis von entzündlichen Darmerkrankungen und Darmkrebs Voraus, neue Ziele für die Therapie zu identifizieren. Geeigneten Tiermodellen wird ein integraler Bestandteil dafür, dass die vielversprechendsten neuen Therapien zur klinischen Studien bewegt werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) MP Biochemicals 160110 Requires batch testing.
Azoxymethane Sigma A5486-100MG Requires batch testing.
Vanilla Protein Shake N/A N/A Available from hospital pharmacies.
Isoflourane PPC M60303 This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key.
70% Ethanol N/A N/A Standard lab reagent.
Coloview miniendoscopic system
Endovision Tricam Karl Storz 20212001-020
Xenon 175 light source with anti-fog pump Karl Storz 20134001
HOPKINS straight Forward Telescope Karl Storz 64301AA
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) Kalr Stroz 61029C
Fubre Optic Light Cable Kalr Stroz 69495ND
Computer and media player software MAC, imovies
Scale Any Any scale suitable for weighing mice.
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References

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Ernst, M., Preaudet, A., Putoczki, T. Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice. J. Vis. Exp. (97), e52383, doi:10.3791/52383 (2015).
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