줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

는 ESC 1. 적응은 무 세포 현탁 배양 피더 37 ° C에서 해동는 ESC 얼음의 은색이 남을 때까지. 10 6 예열 ESC 배지 10 ㎖를 함유하는 비 – 조직 배양 – 처리 된 접시는 ESC 해리 X 2.5 – P1000 피펫을 사용하여 조심스럽게 1 옮긴다. 37 ° C에서 20 시간 및 5 % CO 2의 가습 된 조직 배양기에서 배양한다. 20 시간 후, 부드럽게 10 ml의 혈청 학적 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 현탁 배양을 전송하여 세포를 씻으십시오. 200 x g에서 3 분간 펠렛는 ESC. 회전하는 동안, 저 밀착성 접시 ESC 다시 신선한 배지를 가하여 10. 대기음 상층 액을주의하면서 세포 펠렛을 빠지 피하고, 1 ml의에게 펠렛 셀 신선한 ESC 매체를 추가 할 수 있습니다. P1000 피펫을 사용하여 박테리아 접시에 세포를 전송하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 집계는 육안 (일반적으로 4에 표시 될 때까지 매일 세포를 관찰 – 8 일 (D) 집계는 0.2이됩니다- 0.5 mm). 집계는 4 일 후 식별 할 수없는 경우, 1.3 단계를 반복합니다. 집계 볼 수 있습니다되면, 해리 및 제 2 항에 설명 된대로는 ESC를 유지한다. 2. ESC과 Passaging 및 유지 관리 ESC는 15 ml의 멸균 10 ML의 피펫을 사용하여 원뿔 튜브를 집계 전송하고 집계 소형 펠릿에 정착 할 수 있도록 (일반적으로 3-5 분). 대기음 뜨는, 조심하면 세포 펠렛을 방해하지 않도록, 5 ml의 PBS로 집계를 씻어. 중력 침강 2.5 분 동안 100 XG에서, 또는 펠렛 세포를 사용하는 것이 좋지만 대신 시간을 저장합니다. 대기음 PBS 500 μL 트립신을 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 3 분 동안 트립신의 집계를 품어. 트립신을 희석 부드럽게 집계를 깰 P1000 피펫으로 10 번 씹다 500 μL ESC 매체를 추가합니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 펠렛은 1.0의 최종 농도로 재현 탁하고 200 XG 세포에서 3 분 동안 세포를 해리ESC 매체 X 107 세포 / ml. 전송 (150) 10cm 박테리아 접시에 신선한 ESC 배지 10 ㎖에 μL (1.5 × 10 6 세포), 48 시간 동안 조직 문화 인큐베이터로 돌아갑니다. 10 % DMSO, 또는 폐기 보충 된 90 % ESC 배지에서 5 × 106 세포 / ml – 과잉는 ESC 1에서 동결 보존 차별화 될 수있다. 통로마다 48 시간을 집계합니다. 통과를 위해 준비 골재는 0.5 mm를 초과하는 직경, 명확하게 볼 수 있습니다. 참고 : – 1.4 냉동 보관, 서스펜션 적응 세포의 해동과 문화가 단계 1.2 당 달성된다. 72 시간 – 집계 (48) 내에서 계대에 대한 준비가 될 것입니다. 3. 신경 세포의 분화 참고 : – 정오 이후 이전에 정오에 3.5 단계 3.7 행동 3.1 단계를 반복합니다. 분화 절차의 개요는도 1a에 표시됩니다. 2.5 – 단계 2.1로는 ESC를 떼어 놓다. 해리의 전송 350 μL (3.5 × 10 6)25 ㎖ 분화 배지를 함유 10cm 둘러 부착 접시는 ESC D. 5 % CO 2, 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터 안에 45 RPM – 30으로 설정 진탕에 놓는다. 이 차별화의 첫 날, 시험 관내 (DIV)에서라고 일 -8. 참고 : 매우 낮은 첨부 접시의 사용 방법의 비용을 증가하지만, 집계 가끔 배양 접시에 부착 할 수 있기 때문에 세균 배양 접시보다 약간 큰 수익률을 생산하고 있습니다. 다른 접시 크기를 선호하는 경우, 중간 볼륨 및 세포 수를 그에 따라 확장 할 수 있습니다. 48 시간 (DIV의 -6) 한 후, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 분화 세포 집합체를 전송하기 위해 25 ㎖ 피펫을 사용한다. 즉시 페트리 접시에 차별화 매체의 신선한 25ml를 추가합니다. 2 mm의 깊이 – 1 볼 펠렛을 생산, 5 분 – 골재가 2 이상을 해결 할 수 있습니다. 서스펜션에 남아있는 단일 세포 또는 작은 집계를 무시합니다. 조심스럽게 매체를 대기음 CE를 전송LL 다시 P1000을 사용하여 배양 접시에 펠렛. 조직 문화 인큐베이터에서 회전 진탕에 놓습니다. DIV -4 단계를 반복 3.2에서. 4 mm의 깊이 – 펠렛 2 될 것입니다. 페트리 접시에 6 μm의 모든 트랜스 레티노 산 (RA)로 보충 30 ml의 차별화 매체를 교체합니다. 추가로 48 시간 동안 조직 배양 인큐베이터에서 회전 진탕으로 돌아갑니다. DIV -2 단계를 반복 3.3에서. 이 시점에서 깊이 8 MM – 펠렛 4 될 것입니다. DIV -1에서, 제 4 장에서와 같이 도금 표면을 준비합니다. 조직 배양 후드에서 10 분 플레이스 – DIV 0, 5, 37 ° C에서 미리 분취 및 냉동 NPC를 트립신 처리 배지 5 ㎖를 해동. 이전 50 ML 원뿔 튜브에 집계를 차별화, 25 ML의 피펫을 사용하여. 집계가 정착 조심스럽게 흡인 매체하도록 허용합니다. 워시 집계 세척 사이에 정착 할 수 있도록, 10 ml의 PBS로 두 번 펠렛. 제 PBS 세척 후에, 펠릿 NPC의 트립신 처리 배지 5 ㎖를 추가하여 37 ℃에서 부화6; 5 분 C. 부드럽게 2.5 분 후에 튜브를 가볍게. 트립신을 비활성화하고 반전 혼합 0.1 % 대두 트립신 억제제 (STI)의 5 ML을 추가합니다. 비교적 균질 세포 현탁액이 생성 될 때까지 10 ㎖의 혈청으로 15 회 피펫 – 부드럽게 10 연화. 천천히 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 위치도 40㎛ 70㎛, 셀 스트레이너에 세포 현탁액을 전송. 모든 현탁액을 여과 한 후, 필터를 통해 남아있는 세포를 세척하고 200 x g에서 6 분 동안 해리 된 세포 현탁액을 펠렛 N2 배지 1 ㎖를 추가한다. 펠렛을 방해하지 않고 대기음 매체. 200 XG에 5 분 동안 세포를 펠렛 및 P1000과 세척 사이에서 분쇄하여, 10 ml의 N2 매체로 두 번 세포를 씻으십시오. 두 번째 세척하기 전에 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. / cm 2 셀 200,000 – 150,000의 세포 밀도로하는 ESN ㎖의 판 당 1 × 107 세포에서 N2 배지에서 세포를 재현 탁. 새로 PLAT 이동가습 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터 5 % CO 2 ED하는 ESN과 5 절에서와 같이 유지한다. DIV 0 도금 신경 전구체에 대한 문화 표면 준비 (4) 도금에 최소 1 일전 조직 배양 처리 된 요리를 준비합니다. (PEI를, 멸균 H 2 O 25 ㎍ / ml)에 충분한 폴리에틸렌 이민을 추가 또는 폴리 D 라이신 (PDL을 100 ㎍ / ml의 멸균 H 2 O에)에서 O / N을 플라스틱 요리를 조직 문화가 처리 된 커버 배양 37 ° C. 도금의 아침, 두 번 증류 H 2 O로 두 번 설거지를 한 번 PBS와. 최종 세척 후 요리를 커버 할 수있는 충분한 N2 매체를 추가 (예를 들어, 12 잘 접시 잘 당 1 ml의 또는 6cm 접시 당 4 ㎖). 적어도 전날 신경 도금 18mm 커버 글라스를 준비합니다. 플라즈마 클리닝 4 분으로 청소 된 커버. 즉시의 바닥 에탄올 세척하고 파라 필름으로 세정 된 커버를 전송할큰 멸균 요리와 단계 4.1에서와 같이 제조 PEI 또는 PDL 솔루션의 400 μl를 추가. 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 O / N을 품어. 아침에, 세척 물로 3 회 된 커버는 1 PBS에 5 ㎍ / ㎖의 라미닌을 추가 – 37 ° C에서 3 시간. 이전 신경 세포를 해리로, 라미닌을 대기음 즉시 직면 처리 된면을 유지해야되는 NPC 배지 1 ㎖를 포함하는 12 잘 접시의 잘에 커버 슬립을 전송합니다. 저장 요리와 37 ° C에서 커버 슬립의 NPC 판 할 준비가 될 때까지. 뉴런 5. 유지 보수 그리고 DIV 1, 흡인 매체에서 N2 배양액으로 교체합니다. 그리고 DIV 2, 4, 흡인 매체에서 B27 배양 배지로 교체. DIV 8에서 대기음 매체와 B27의 배지를 포함하는 유사 분열 억제제로 교체가 아닌 신경 세포를 오염 제거합니다. DIV 12, B27 배양 배지로 교체합니다. DIV를 제거하지 마십시오준비가 될 때까지 5 % CO 2 12 +하는 ESN은 사용할 수 있습니다. 미니어처 흥분성 시냅스 후 전류를 정량화를위한​​ 시냅스 전달 (MIST) 분석 6. 측정 억제 주의 : – 1 NG / kg 클로스 트리 디움 신경독 0.1의 낮은 예상 인간의 LD 50 값으로 알려진 가장 독성 물질이다. 이 독소를 사용하여 적절한 예방 조치를 사용하기 전에 필요한 승인을 얻습니다. 조심스럽게 37 ºC에 원하는 최종 ESN 배양 배지의 농도와 따뜻한을 100 배 본트 / A를 희석. 21 + ESN 문화를 DIV 배양 접시를 소용돌이 및 인큐베이터로 돌아 독소의 적절한 볼륨을 추가합니다. 세포가 중독 후 4 개 이상의 시간을 분석 할 경우, 이러한 직접 인큐베이터에서 또는 일정한 CO 2 실에서, 5 % CO 2에서 제거하지 않고 요리와 소용돌이에 독소를 추가합니다. 적절한 시점에서, ASPIRATE ESN 배양 배지 및 세포 외 기록 버퍼 (ERB)로 두 번 세척 하였다. ERB의 추가 4 ㎖를 각각 활동 전위를 차단하고 GABA에게 수용체 활동을 반감, 5.0 μM 테트로도톡신 10 μM의 bicuculline 보충. 전기 생리학 장비에 접시를 전송합니다. 어느 관류도 온도 제어는 MIST 분석이 필요합니다. 저항의 5 ~ 10 밀리 옴으로 기록 피펫을 생산하고 세포 내 기록 버퍼 채우기 위해 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리를 잡아 당깁니다. 부드럽게 기록하기 전에 시약을 siliconizing 채워 기록 피펫을 찍어. 기록 피펫은 ERB 내로 하강으로 공기 – 충전 된 주사기를 사용하여, 양압을 제공한다. 부드럽게 기록되는 뉴런 소마상의 기록 피펫 착륙 후 양압을 제거한 기가 시일을 형성한다. MV -70 유지 전압을 낮 춥니 다. 조심스럽게 전체 셀 구성에 침입 음압을 적용합니다. 모니터링하고 막 잠재력을 휴식 기록하는 전류 클램프로 전환합니다. 액체 접합 전위에 대한 조정없이, 휴식 막 잠재력은 -82에 -67 사이의 MV 될 것입니다. 소형 흥분성 시냅스 후 전류 (mEPSCs)를 검출하기 위해 5 분 – 4 연속 -70 MV 전압 클램프 녹음을 수행합니다. 다음과 같은 설정으로 스파이크 탐지 소프트웨어를 사용하여 mEPSC 검출을위한 기록 된 데이터의 4 분 분석 : 임계 값, 5; 기간은 로컬 최대를 검색, 10,000 마이크로 초; 기준에 대한 피크 전에 시간, 5,000 마이크로 초; 기간은 감쇠 시간을 검색하려면 20,000 마이크로 초; 피크의 분수는 0.37를 감쇠 시간을 찾기 위해; 기간이 기준을 평균 1,000 마이크로 초; 임계 영역, 20; 평균 피크, 1 점의 수; 피크의 방향, 음. 수집 및 감지 이벤트에 대한 정보를 저장합니다. mEPSC Hz 단위 주파수를 결정하기 (240)에 의해 4 분에서 검출 된 이벤트의 수를 나눈다. 12 계속 – 8 mEPSC 주파수를 수집rols 8 – 각각의 노출 조건에 대한 12 본트 처리 된 샘플. 나이와 많은-대조군에 대한 주파수를 분석 할 수 있습니다. 일원 분산 분석 테스트 및 던넷 사후 테스트를 사용하여 시냅스 활동의 억제 %의 통계적 유의성을 확인합니다.