Lokalize Histopatolojik Analiz için bir Retina Protez ile implant İşleme Teknikleri Gözler için: Bölüm Retina Tacks ile 2 Epiretinal İmplantlar
Summary
Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Abstract
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Introduction
Retinitis pigmentosa (RP) nöral aktivitenin içine, fotonların şeklinde, ışık transdüklenmesinden sorumlu retinanın en dış tabakasındaki hücreler olan fotoreseptör, yaygın kaybına neden olur kalıtsal bir hastalıktır. Önemlisi, RP hastalar genellikle hala işlevsel onların retinanın diğer katmanları artık nöronlar var. Retina protezleri görsel yolu 1,2 etkinleştirmek için elektrik stimülasyonu ile bu hayatta nöronlar hedefleyerek bu hastalara bazı sınırlı vizyon geri yeteneğine sahiptir. Klinik çalışmalarda Algısal sonuçları erken dönem sonuçları umut verici gösterilmiştir ve son zamanlarda bazı cihazlar ticari kullanım için onaylanmıştır. Subretinally 5,6 ve 7,8 suprachoroidally epiretinally 3,4,: Şu anda, üç ana anatomik klinik retina protezleri yerleştirilmiş edildiği yerleri vardır. Farklı cihazlar farklı malzemeler kullanmak ve onların formu özelleştirilmişOnlar implante edildiği yere. Ancak, tüm elektrik darbeleri ile retinanın kalan nöronlar aktive ederek görsel gözlemleri oluşturun.
Herhangi bir tıbbi protez nedeniyle ilk yerleştirme mekanik etkilere veya sonradan devam eden kuvvetler çevre dokulara zarar için potansiyeli vardır. Retinal protezler gibi implante uyarıcıları, durumunda, elektriksel parametre güvenli sınırlar içinde olması gereken ek bir düşünce de bulunmaktadır. Hasta güvenliği her şeyden önemlidir, bu nedenle cihazların titizlikle klinik 9-15 ayar geçmeden önce preklinik çalışmalarda test edilmelidir. Bizim tamamlayıcı madde olarak, suprakoroidal boşluk 16 içinde yer alan bir implant çevreleyen göz lokalize histopatolojik değerlendirilmesi için bir yöntem açıklamıştır. Bu yazıda, (fe bir klinik öncesi de epiretinally retinaya tutturdu bir elektrot dizisi, çevredeki göz dokusunu görselleştirmek için bir teknik tarifçizgi) modeli (Şekil 1).
Epiretinal konumu görsel protez bulmak için en sık kullanılan konumdur. Burada yer alan elektrot diziler genellikle göz 17-20 tüm katmanları nüfuz metal tack ile retina yapıştırılmıştır. Önce bu yazıda anlatılan teknikleri, doğru bir retinal ve hemen bir yapışmaya çevreleyen diğer dokulara değerlendirmek zor oldu. Nötr tamponlu formalin kullanarak standart göz fiksasyon nedeniyle tack sabit noktaya karşı retina ve sklera diferansiyel hareketine artefakt retina hasarına neden olmuştur. Bu nedenle tack ve Epiretinal dizi kaynaklanan herhangi bir gerçek hasar doğru tespit edilemedi. Metal nesneler kolayca geleneksel histolojik aparatı ile kesilmiş olamaz Buna ek olarak, göz dokusu kesit yerinde retina yapışma ile yapılabilir olamazdı; histolojik işlem de önce yapışma çıkarmadanBu da suni retina hasara yol açtı gibi istenmeyen.
Bu çalışmanın iki amacı vardı: yapışma ve Epiretinal implant dizi kaynaklanan herhangi bir hasar güvenilir değerlendirilebilir böylece 1) retina dekolmanı eseri azaltmak için; ve 2) çıkarmadan tack bitişik retina mimari görselleştirmek için. Suni retina delaminasyona azaltır, (yardımcı madde 16 de tarif edildiği gibi) amaca 1 elde etmek için, yeni bir tespit tekniği kullanılmıştır. Amaca 2 elde etmek amacıyla, taşlama ve başlangıçta koklear implant elektrotlar 21-23 in situ gözlenmesi için geliştirilen tekniği, parlatma, bir gömme modifiye. artefakt retina hasarı en aza indirmek ve bu nedenle yapışma ve Epiretinal dizi neden olası hasar doğru değerlendirilmesini izin verirken, bu yazıda anlatılan yöntemler yerinde bir çivinin çevreleyen retina görselleştirme ve bitişik sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Standart histolojik teknikler nedeniyle, metal, cam ya da elmas bıçakları ile bu nesneleri kesme sınırlamalara yerinde sert metal implantları işleme koyamıyoruz. Bizim arkadaşı kağıdı 16, biz bir modifiye bütün göz tespit tekniği kullanılması artefakt retina Delaminasyonu azaltabileceğini gösterdi. Mevcut yazıda, bir taşlama kurdu ve yerinde 21-23 retina protezler için modifiye edilmiş koklear implant görselleştirmek için teknik parlatma. Retinaya bir elektrot dizisi sabitlemek için kullanılan bir titanyum çakmak, epiretinally, çevredeki göz dokusu ile birlikte epoksi gömülü edildi. Bu reçine bloğu daha sonra metal tack hemen bitişiğinde doku morfolojisi ortaya çıkarmak için uygun odaklı ve giderek zemin / cilalı oldu. Çeşitli derinliklerde bloğun cilalanmış yüzeyinin görüntüleri güçlü bir diseksiyon mikroskobu ile alınmıştır. Görselleştirilmesi ve değerlendirme,: Bu teknik için kullanışlıdırEpiretinal implanta komşu doku yanıtı ing; İmplant implantasyonu ile ilişkili cerrahi travmayı değerlendirmek için; Sert metal bileşenleri biyolojik reaksiyonu belirlemek için; ve implantın ve retina yüzeyi arasındaki mesafeyi ölçmek için.
Bu teknik gözünde retina yapışma veya diğer sert (örneğin, metalik) nesnelerin bitişik bölgenin yerinde görselleştirme için gelecekte güvenlik çalışmalarında yararlı olacaktır. Bu epiretinally retinaya tutturdu protezlerin klinik öncesi güvenliğini değerlendirmek doğrudan uygulama vardır. Aynı zamanda, alt retina konumda implantlar ile temas içinde retina bölgelerinde doku hasarını değerlendirmek için yararlı olabilir.
Tekniği doğru yapılmış olduğunu doğrulamak için çeşitli yollar vardır. Her aşamada, retina gözün dış katmanlara bağlı kalmalıdır. Brüt artefakt retina dekolmanı varsa, bu Hindu olabilirtespitle ilgili bir sorun yedik. Örnek gömülü olduğu ve bloğun taşlama-yüzü ile ortogonal yakın olmalıdır retina engellemek son reçine içinde odaklı yeniden zaman; Bu eğik kesme minimize edecektir. Bu (örneğin bir retina yapışma gibi) bir nesneyi hareket için gerekli (bilinen adım boyutu) artan öğütme adım sayısı nesnesinin boyutları ile buna bağıntılı olduğunu kontrol etmek yararlıdır.
Teknik, birkaç şekilde optimize edilebilir. Öğütme işlemi ile bağlantılı epoksi bloğun yüzeyinde çizikler tedricen daha ince dereceli parlatma ile azaltılabilir. Bu çalışma için, biz 800, 1000, 1200, 2400, ve 4000 grade silikon karbür kağıdı kullanıldı. Elmas macun ayrıca, yüzey geliştirmek için kullanılabilir. Bir ince yüzey yüksek kaliteli görüntü verir ama ek parlatma zaman pahasına. Bu tekniğin sonuçlarını iyileştirmek için bir başka kritik husus opti seçim ve kalitesics ve aydınlatma görüntü yakalama için kullanılan. Diğer temel histolojik lekeleri – özellikle Nissl lekeleri, toluidin mavisi yerine kullanılabilir, ancak daha da optimizasyon ihtiyacı olabilir. Bazı lekeler reçine yanı sıra doku (örneğin, Eosin), bu nedenle sığ bir lehçe arka plan renk değişimi kaldırmak için boyama sonrası gerekebilir leke olacaktır. Uzman lekeler, flüoresan boyalar ve immünohistokimyasal teşebbüs değildi, ama çok özel bir sonuç arzu edildiği takdirde, her bir taşlama seviyesinde bu lekeleri gerçekleştirmek için gereken zaman engelleyici olması muhtemeldir. Bununla birlikte, yerleştirme basamak (adım 3.4) 24 önce, bir bütün olarak doku leke mümkün olabilir.
Bu tekniğin ana sınırlama bu nedenle taşlama ve parlatma her aşamasında büyütme çeşitli birçok (muhtemelen gereksiz) görüntüleri yakalamak için ihtiyatlı olduğunu, ilgi bölgesi uzak zemin edildikten sonra, bu alınamaz olmasıdır. ÖyleAyrıca önemli her taşlama derinlik ayarı için küçük artışlarla kullanmak için. Bu tekniğin bir başka sınırlama olduğu dokuya cam slayt üzerine monte edilmiş ve bir standart (iletim) ışık mikroskobu ile inceledi ile karşılaştırıldığında optik büyütme ve çözünürlük. Prototip ve yeni bir implant cihazının güvenliğini değerlendirmek amacıyla, brüt patolojik değerlendirme birincil ilgi olduğunu. Bu teknik, bir retina yapışma ile ilişkili klinik olarak önemli hasar gözlemlemek için etkili bir yöntem sağlar. Uygulamada, eziyet, cila toplamak ve (bir zamanlar gömülü) verilen örnek fotoğraflamak için gerekli genel Zamanla bu bölümüne bir parafin blok veya dondurulmuş bölümü alacağını zaman karşılaştırılabilir.
Retina implantların kapsamı dışında uygulamalara uzatılabilir mevcut tekniklerin potansiyeli de vardır. Bu teknik, implant ekstre feasib olmayan bir sabit implant bitişik doku değerlendirmek için uygundurle veya arayüz zarar olacaktır. Örneğin, bu yöntem, ilaç iletimi için derin beyin ya da periferal sinir elektrot kanüller gibi geleneksel histolojik teknikler ile kesilemezler metal (örneğin, platin, nitinol, vs.) yapılmış implantlar değerlendirmek için genişletilebilir, vasküler stentler veya ortopedik protezler.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Materials
| Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
References
- Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. Visual prostheses for the blind. Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).
- Santos, A., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
- Humayun, M. S., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
- Roessler, G., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
- Chow, A. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).
- Fujikado, T., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).
- Saunders, A. L., et al. Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis. Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).
- Lee, S. W., et al. Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).
- Sakaguchi, H., et al. Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes. Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).
- Majji, A. B., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Walter, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
- Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).
- Colodetti, L., et al. Pathology of damaging electrical stimulation in the retina. Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).
- Nayagam, D. A. X., et al. Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study. PLoS One. 9, e97182 (2014).
- Nayagam, D. A. X., et al. Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).
- Laube, T., et al. Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs. Graefe’s Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).
- Gerding, H., et al. Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).
- Seo, J. -. M., et al. Silicon retinal tack for the epiretinal fixation of the polyimide electrode array. Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).
- Hadjinicolaou, A. E., et al. Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis. Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).
- Briggs, R. J., et al. Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode. Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).
- Shepherd, R., et al. An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies. Hear Res. 277, 20-27 (2011).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21, 205-211 (2000).
- Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy. Brain Res. 1000, 200-210 (2004).
