Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una retina Protesi per Localized istopatologico Analysis: Part 2 epiretinica impianti con retina aderenze
Summary
Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Abstract
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Introduction
Retinite pigmentosa (RP) è una malattia ereditaria che provoca perdita diffusa dei fotorecettori, che sono le cellule nello strato più esterno della retina responsabile trasduzione luce, sotto forma di fotoni, in attività neurale. È importante sottolineare che i pazienti con RP hanno tipicamente neuroni residui negli altri strati della loro retina che sono ancora funzionali. Protesi retiniche sono in grado di ripristinare una certa visione limitata a questi pazienti di mira questi neuroni superstiti con stimolazione elettrica per attivare il loro percorso di 1,2 visiva. Esiti percettivi da studi clinici hanno mostrato promettenti risultati iniziali e recentemente alcuni dispositivi sono stati approvati per l'uso commerciale. Attualmente, ci sono tre principali sedi anatomiche in cui sono state posizionate le protesi retiniche clinici: epiretinally 3,4, 5,6 e subretinally suprachoroidally 7,8. Dispositivi diversi utilizzano diversi materiali e la loro forma è personalizzatoalla posizione in cui sono impiantati. Tuttavia, tutti creano percezioni visive attivando i neuroni residui della retina con impulsi elettrici.
Vi è la possibilità di qualsiasi protesi mediche per danneggiare il tessuto circostante a causa di effetti meccanici del collocamento iniziale o successive forze in corso. In caso di stimolatori impiantabili, quali protesi retiniche, vi è la considerazione aggiuntiva che i parametri elettrici devono essere entro limiti di sicurezza. La sicurezza del paziente è fondamentale, quindi i dispositivi deve essere rigorosamente testato in studi preclinici prima di passare alla creazione di una clinica 9-15. Nel nostro articolo compagno, abbiamo descritto un metodo per la valutazione della istopatologia localizzata dell'occhio circostante un impianto posizionato nello spazio sovracoroideale 16. Nel presente manoscritto, si descrive una tecnica per la visualizzazione dei tessuti oculari che circonda una matrice di elettrodi appiccicato alla retina epiretinally, in un preclinico (feline) Modello (Figura 1).
La posizione epiretinal è la posizione più comunemente utilizzato per localizzare una protesi visiva. Array elettrodi situati qui sono tipicamente apposte alla retina con una virata metallo che penetra tutti gli strati dell'occhio 17-20. Prima le tecniche descritte nella presente manoscritto era difficile valutare con precisione la retina e altri tessuti immediatamente circostanti una virata. Fissazione dell'occhio standard con formalina tamponata neutra provocato danni alla retina artefatta a causa del movimento differenziale della retina e sclera contro il punto fisso della mura. Pertanto i danni reali causati dalla virata e la matrice epiretinal non poteva essere osservato con precisione. Inoltre, sezionando il tessuto oculare non poteva essere eseguita con l'aderenza della retina in situ come oggetti metallici non possono essere isolate con le apparecchiature tradizionali istologica; rimuovere la virata prima della trasformazione istologica era ancheindesiderabile in quanto ciò ha comportato anche danni alla retina artefatta.
Lo scopo del presente studio è stato duplice: 1) per ridurre il distacco della retina manufatto in modo che eventuali danni causati dalla virata e l'array dell'impianto epiretinal può essere valutato in modo attendibile; e 2) per visualizzare l'architettura retinica adiacente al tatto senza rimuoverla. Per raggiungere obiettivo 1, una nuova tecnica di fissaggio è stata utilizzata (come descritto nell'articolo guidata 16), che riduce artefatti delaminazione retinica. Al fine di conseguire l'obiettivo 2, abbiamo modificato un embedding, rettifica, e la tecnica, originariamente sviluppato per l'osservazione in situ di cocleari elettrodi impianto 21-23 lucidatura. I metodi descritti in questo manoscritto consentono la visualizzazione della retina circostante e adiacente ad una virata in situ, riducendo al minimo i danni della retina artefatta e consentendo quindi una valutazione accurata di eventuali danni causati dalla virata e la matrice epiretinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tecniche istologiche standard sono in grado di elaborare le protesi in metallo duro in situ a causa di limitazioni nel taglio di questi oggetti di metallo, vetro o anche dischi diamantati. Nel nostro compagno di carta 16, abbiamo dimostrato che l'uso di una tecnica di fissazione intero-eye modificato potrebbe ridurre artefatti delaminazione della retina. Nel manoscritto corrente, un consolidato smerigliatura e lucidatura tecnica per la visualizzazione di impianti cocleari 21-23 in situ è stato modificato per protesi retiniche. Una virata di titanio, utilizzato per proteggere una matrice di elettrodi alla retina, epiretinally, è stato incorporato in resina epossidica con il tessuto oculare circostante. Questo blocco di resina è stata poi orientato in modo appropriato e terra / progressivamente lucido per rivelare la morfologia del tessuto immediatamente adiacente alla virata di metallo. Immagini della superficie lucida del blocco a varie profondità sono state prese con un potente microscopio di dissezione. Questa tecnica è utile per: Visualizzazione e evaluating la risposta del tessuto adiacente all'impianto epiretinal; per valutare il trauma chirurgico associato con l'impianto della protesi; per determinare la reazione biologica ai componenti in metallo duro; e per misurare la distanza tra l'impianto e la superficie della retina.
Questa tecnica sarà utile in studi di sicurezza per future in situ visualizzazione della regione adiacente ad una virata retina o altri (ad esempio metallico) oggetti duri nell'occhio. Questo ha applicazione diretta nella valutazione della sicurezza preclinica di protesi virato alla retina epiretinally. Può anche essere utile per valutare il danno tissutale in regioni retina a contatto con impianti situati in posizione sub-retinica.
Ci sono diversi modi per verificare che la tecnica è stata eseguita correttamente. In ogni fase, la retina dovrebbe rimanere aderente agli strati esterni dell'occhio. Se vi è il distacco di retina artefatta lordo, ciò può indianemangiato un problema con il fissaggio. Quando il campione è incorporato e ri-orientato nella resina finale bloccare la retina deve essere vicino ortogonale alla faccia di macinazione del blocco; Questo ridurrà al minimo il taglio obliquo. È utile per verificare che il numero di passaggi di macinazione incrementali (noto di step size) necessaria per attraversare un oggetto (quale un tack retinica) correlare conseguenza con le dimensioni dell'oggetto.
La tecnica può essere ottimizzato in diversi modi. Graffi sulla superficie del blocco epossidica associato al processo di macinazione possono essere ridotti con progressiva lucidatura grado più fine. Per questo studio, abbiamo utilizzato 800, 1000, 1200, 2400, e 4000 carta al carburo di silicio. Pasta diamante potrebbe essere utilizzato anche per migliorare la finitura superficiale. Una finitura superficiale più fine dà un'immagine di qualità superiore, ma a costo di tempo lucidatura supplementare. Un'altra considerazione importante per migliorare l'esito di questa tecnica è la scelta e la qualità del optics e l'illuminazione utilizzati per la cattura delle immagini. Altre macchie istologiche di base – in particolare le macchie di Nissl, possono essere utilizzati al posto del blu di toluidina, ma potrebbero richiedere un'ulteriore ottimizzazione. Alcuni macchie si macchia la resina e il tessuto (ad esempio, eosina), quindi uno smalto superficiale può essere richiesto dopo la colorazione per rimuovere sfondo scolorimento. Macchie specializzati, coloranti fluorescenti e colorazione immunoistochimica non è stato tentato, ma a meno che un risultato molto specifica è desiderato, il tempo richiesto per eseguire queste macchie a ciascun livello di macinazione è probabile che sia proibitivi. Tuttavia, può essere possibile macchiare il tessuto nel suo insieme prima della fase di incorporamento (passo 3.4) 24.
Il limite principale di questa tecnica è che una volta che la regione di interesse è stato macinato distanza, non può essere recuperato, pertanto, è prudente catturare molte immagini (eventualmente ridondanti) in una varietà di ingrandimenti in ogni fase di levigatura e lucidatura. Èanche importante utilizzare piccoli incrementi per ogni regolazione della profondità di macinazione. Un altro limite di questa tecnica è che la ingrandimento ottico e risoluzione rispetto a tessuto montato su un vetrino e visualizzato con uno standard (trasmissione) microscopio ottico. Ai fini della prototipazione e valutazione della sicurezza di un dispositivo di impianto romanzo, la valutazione patologica lordo è di interesse primario. Questa tecnica offre un metodo efficiente per osservare i danni clinicamente rilevanti associati con una virata retina. Con la pratica, il tempo complessivo necessario per raccogliere grind, polacco e fotografare un dato campione (una volta integrati) è paragonabile al tempo che ci vuole per la sezione di un blocco di paraffina o sezioni congelate.
Vi è anche la possibilità per le attuali tecniche per essere esteso alle applicazioni al di fuori dell'ambito di impianti retinici. Questa tecnica è adatta per valutare il tessuto adiacente ad un impianto fisso, in cui l'estrazione dell'impianto non feasible o danneggerebbero l'interfaccia. Ad esempio, questa tecnica può essere espansa per valutare protesi in metallo (ad esempio, platino, nitinol, etc.) che non può essere tagliato con tecniche istologiche convenzionali, come alcuni cerebrale profonda o elettrodi nervose periferiche, cannule per la somministrazione di farmaci, stent vascolari o protesi ortopediche.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Materials
| Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
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