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신경과학

Microdissection laser - une démonstration de l'isolement de la dopamine neurones individuels et de l'Espace ventrale tegmentale entière

Published: February 06, 2015
doi:
10.3791/52336
, ,
1Department of Basic Sciences,Mississippi State University College of Veterinary Medicine

Summary

L'isolement des neurones dopaminergiques individuels ou l'aire tegmentale ventrale par immunohistochimie directe ou indirecte est démontrée en utilisant microdissection laser. Les paramètres pour l'isolement d'un tissu à partir d'une lame de verre en utilisant un laser infrarouge et de diapositives membrane en utilisant la combinaison d'un laser infrarouge et ultraviolet sont discutés.

Abstract

microdissection par capture laser (LCM) est utilisé pour isoler une population concentrée de cellules individuelles ou des régions anatomiques précis de tissu à partir de coupes de tissus sur une lame de microscope. Lorsqu'il est combiné avec l'immunohistochimie, LCM peut être utilisé pour isoler des cellules individuelles types basés sur un marqueur de protéine spécifique. Ici, la technique de LCM est décrit pour la collecte d'une population spécifique de neurones dopaminergiques directement marquées avec de la tyrosine hydroxylase immunohistochimie et pour l'isolement du neurone dopaminergique contenant région de l'aire tegmentale ventrale utilisant indirect tyrosine hydroxylase immunohistochimie sur une section adjacente à celles utilisées pour LCM. Une infrarouge (IR) de capture laser est utilisé pour disséquer les deux neurones individuels ainsi que l'aire tegmentale ventrale de fermeture des lames de verre et sur un capuchon de LCM pour analyse. La déshydratation complète du tissu avec 100% d'éthanol et le xylene est critique. La combinaison de la capture laser à infrarouge et l'ultraviolet (UV) Cutting laser est utilisé pour isoler les neurones dopaminergiques individuels ou l'aire tegmentale ventrale lors de l'utilisation de la membrane diapositives PEN. Coulisse de PEN membrane présente des avantages significatifs par rapport à une lame de verre comme il offre une meilleure consistance dans la capture et la collecte des cellules, est plus rapide collecter de grands morceaux de tissu, est moins dépendant des résultats de la déshydratation et l'élimination complète du tissu à partir de la diapositive. Bien que l'élimination de grandes zones de tissu à partir d'une lame de verre est possible, il est considérablement plus longue et laisse souvent peu de tissu résiduel derrière. Les données présentées ici démontrent que l'ARN de la quantité et qualité suffisante peut être obtenue en utilisant ces procédures pour des mesures quantitatives de PCR. Bien que l'ARN et l'ADN sont les molécules les plus isolées de tissus et cellules recueillies avec LCM, l'isolement et la mesure des microARN, les protéines et les changements épigénétiques de l'ADN peuvent également bénéficier de la résolution anatomique et cellulaire améliorée obtenue en utilisant LCM.

Introduction

Tous les tissus se compose d'une population de cellules hétérozygotes. Ceci est particulièrement pertinent pour les tissus du cerveau, constitué de différents neurones morphologiquement et / ou neurochimique distincts entourés de divers types de cellules gliales (oligodendrocytes, la microglie et les astrocytes). En outre, des régions distinctes dans le cerveau, comme les zones du cortex ou du tronc cérébral noyaux, ont des fonctions spécifiques. Par conséquent, la capacité d'isoler des populations spécifiques de cellules ou de très petites zones anatomiquement distincts, lorsqu'il est combiné avec des techniques d'analyse (par exemple, Q-PCR, microarrays, ARN-séquençage, et protéomique), peuvent sensiblement améliorer la compréhension des différents processus biologiques. LCM est une technologie qui offre la possibilité d'isoler des zones anatomiques très discrets ou de cellules spécifiques d'un tissu sur une lame de microscope en fournissant une source beaucoup plus homogène pour une analyse ultérieure de diverses molécules, telles que l'ARN, micro-ARN, l'ADN et les protéines.

t "> Depuis LCM a été introduit, plusieurs approches différentes ont été utilisées pour les cellules d'un tissu microdissect 3.1. Les premières approches compris la fixation directe d'un tissu sur une lame en utilisant un (IR) et un laser infrarouge et un film thermoplastique non Procédé de contact à l'aide d'un rayonnement ultraviolet (UV) de coupe laser pour détacher une cellule ou un tissu et collecte dans un tube. Par la suite, LCM a été utilisé avec succès sur une grande variété de tissus et de types de cellules et représenté pour être compatible avec l'isolement de diverses molécules pour l'analyse en aval y compris l'ARN, les microARN, l'ADN et les protéines, y compris l'activité enzymatique 1,4-7. Voici LCM est démontrée en utilisant l'un système de LCM qui utilise une découpe laser UV et un laser capture d'IR pour couper autour des cellules ou des tissus et en l'attachant à un LCM capuchon, respectivement. Ce système de LCM utilise à la fois la capture laser IR à l'état fondu un film plastique sur un plafond au-dessus de la cellule ou du tissu d'intérêt qui se fixe aux cellules de la feuille de matière plastique et le supprime de til tissu à l'enlèvement du capuchon (figure 1). En outre, en combinaison avec le laser IR, un laser UV est disponible pour découpe des tissus ou cellules d'intérêt à partir de tissus montées sur des lames avec une membrane puis isolé par fixation du tissu à la capsule de LCM utilisant le laser IR (figure 2). Un bref aperçu de ces techniques se trouve dans les figures 1 et 2.

Plusieurs variantes de cette technique sont décrits afin d'isoler des cellules spécifiques en utilisant l'immunohistochimie fluorescente directe et une technique d'immunohistochimie indirecte guidée qui est utilisé pour l'isolement d'une région de tissu sur la base de l'expression d'une protéine spécifique. Plus précisément, l'isolement des neurones dopaminergiques de la substance noire et l'isolement de l'aire tegmentale ventrale et l'isolement subséquent de l'ARN à partir de frais, congelé les tissus du cerveau sont représentés. Comme l'ARN est la plus labile des molécules mesurées (par rapport à l'ADN ou protéine), de steps pour aider à préserver l'intégrité de l'ARN sont inclus et les données indiquées sur la quantité et la qualité de l'ARN obtenu.

Protocol

REMARQUE: les tissus du cerveau de souris a été utilisé conformément aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, et des protocoles d'étude ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université d'État du Mississippi. 1. Préparation des lames et de tissus Utilisez soit diapositives Silane-Prep ou polyéthylène naphtalate (PEN) des lames de verre de la membrane. Pour l'isolement de l'ARN, plaques d'immersion dans une solution de décontamination RNase, laver trois fois à l'eau sans RNase puis déshydrater avec une série graduée de RNase éthanol et sèche sous vide pendant 30 min. Couper des coupes de tissus à 10 um d'épaisseur en utilisant un cryostat et monter sur les diapositives gratuits préparés RNase. Gardez les sections gelés pendant la coupe pour préserver la qualité de l'ARN. REMARQUE: Assurez-vous que le tissu est d'environ 4 mm des bords de la diapositive comme LCM ne peut pas enlever le tissu qui est trop près des bords de la diapositive. Dans order pour enlever le tissu de la membrane une lame de PEN, en sorte que le tissu est de 4 mm depuis le côté gauche, en haut et en bas et de 7 mm à partir du côté droit de la diapositive qui sont les dimensions de la membrane qui ne est pas attaché à la lame. Pour l'isolement des populations de cellules individuelles en utilisant l'immunohistochimie directe, la section sur le tissu soit les diapositives de silane-prep ou diapositives membranaires PEN. Pour l'isolement des régions de tissu en utilisant des techniques guidées d'immunohistochimie indirecte, monter une série de sections sur une lame de Silane-prep pour l'immunohistochimie et des sections alternées de part et d'une lame de membrane PEN et / ou une lame de Silane-prep à utiliser pour la LCM. 2. Préparation des tissus pour Laser Capture – Rapid tyrosine hydroxylase immunohistochimie pour Direct capture laser de cellules immunoréactives Décrivez le tissu avec un stylo hydrophobe et laisser sécher. Fixer le tissu dans un mélange acétone-méthanol (1: 1) solution à -20 ° C pendant 10 min. REMARQUE: Our expérience a montré que la fixation de l'acétone et de methanol a donné lieu à immunohistochimie beaucoup plus cohérent que l'acétone ou le methanol seul. Diaporama rinçage en tampon phosphate salin (PBS) avec 1% de Triton (RNase). Couvrir les coupes avec 100-200 pi de PBS avec 1% de Triton avec un anticorps tyrosine hydroxylase dilués 1: 100 avec 400 U / ml RNasin. Incuber pendant 5-10 min. Rincer brièvement dans PBS deux fois et PBS-1% de Triton. Couvrir le tissu avec 100-200 ul de chèvre anti-IgG de lapin marqué avec Alexa Fluor 488 dilué à 1: 100 dans du PBS-1% de Triton avec 400 U / ml de RNasin et 50 ng / ml de DAPI. Incuber pendant 5 min. Rincer deux fois dans du PBS puis déshydrater 30 s dans une série graduée de RNase éthanol libre (75% -75% -95% -95% -100% -100%). Incuber dans deux lavages de xylène pendant 1 min, puis 5 min. Retirer les lames de Xylène immédiatement avant à utiliser pour LCM et laissez sécher à l'air. 3. Préparation des tissus pour Laser Capture – TyrosineHydroxylase immunohistochimie indirecte pour capture laser des régions immunoréactives Processus une diapositive avec des sections adjacentes aux sections montées sur du silane-prep et / ou PEN diapositives membranaires pour l'immunohistochimie. Nota: Les procédures utilisées ici sont similaires à ceux rapportés précédemment 5. Pour les images de démonstration, la diaminobenzidine (DAB) réaction de chromagène a été utilisé pour visualiser les neurones tyrosine hydroxylase d'intérêt. Pour les diapositives utilisées pour LCM, fixer pendant 5 min dans 100% d'acétone à 4 ° C. Déshydrater le tissu dans une série graduée de RNase éthanol gratuit (75% -75% -95% -95% -100% -100%) pendant 1 min chacun. Incuber dans deux lavages de xylène pendant 1 min, puis 5 min. Retirer les lames de Xylène immédiatement avant à utiliser pour LCM et laissez sécher à l'air. 4. Utilisation du système de microdissection par capture laser REMARQUE: Le programme d'application de LCM a 10 Les barres d'outils et deux fenêtres pour contrôler laprocédure de microdissection. Barres d'outils: 1. Microscope, 2. capture laser, 3. Découpe laser, 4. étude, 5. Navigation, 6. Matériaux, 7. Groupes de capture, 8. Microdissection, 9. police, 10. Annotation. Windows: 1. en direct vidéo et 2. Feuille de route. Ouvrez la porte en sélectionnant l'onglet "Ouvrir la porte» dans la barre d'outils des matériaux dans le logiciel système de LCM. Charger les lames sur les trois emplacements disponibles. Pour cette démonstration, charge une diapositive avec la tyrosine hydroxylase immunohistochimie visualisée avec DAB, une lame de Silane-prep et une lame de PEN membrane étiqueté pour chaque rapide tyrosine hydroxylase immunohistochimie fluorescente. Dans une expérience typique, soit utiliser l'acétone non marqué sections fixes avec une lame de référence étiqueté pour tyrosine hydroxylase utilisant DAB ou des diapositives directement marqués avec fluorescente tyrosine hydroxylase pour la capture laser. Chargez les bouchons de LCM dans le connecteur disponible. NOTE: bouchons Macro et HS LCM sont disponibles pour utilisation. Le type de bouchon de LCM à utiliser depend du nombre de cellules ou de tissu montant à percevoir. Macro diapositives sont énumérés à gagner jusqu'à plusieurs milliers de cellules tout en bouchons SH peuvent recueillir plusieurs centaines. Les diapositives Macro permettent plus de collecte de tissus, mais exigent 50 pi de tampon de lyse. Le capuchon de HS, lorsqu'il est utilisé avec les adaptateurs, ne nécessite que 10 ul de tampon de lyse qui permet une plus grande récupération d'ARN proportionnel. Fermer la porte. Charger la diapositive pour activer la fenêtre Feuille de route qui offre une vue de travail de l'ensemble du diaporama, ce qui permet pour la sélection de la région d'intérêt (Figure 3). Voir la feuille de route sur la fenêtre vidéo en direct pour accéder à la zone d'intérêt. Dans la barre d'outils des matériaux, identifier les diapositives de la membrane PEN en cochant la case ci-dessus de la fente de coulissement. Pour fournir des propriétés de capitalisation, un clic droit sur les bouchons dans la barre d'outils de Matériaux et sélectionnez «Cap propriétés d'approvisionnement". Cochez les cases indiquant la position des bouchons et sélectionnez Macro ou SH casquettes. Sélectionnez l'onglet "fluorescence" dans la barre d'outil de Microscope pour allumer la lampe fluorescente et permettre à la lampe fluorescente se réchauffer. Utilisez les filtres bleues et UV pour visualiser la Alex Fluor 488 et DAPI, respectivement. Utilisez l'onglet "Réglez l'appareil photo" pour augmenter la sensibilité de l'image afin de voir les cellules marquées par fluorescence. Dans la barre d'outils des matériaux, un clic droit sur un capuchon et le déplacer vers la diapositive d'intérêt. Double-cliquez sur un emplacement dans la feuille de route pour sélectionner la région qui se affiche dans la fenêtre vidéo en direct. Déplacez le bouchon autour de la diapositive en sélectionnant une zone sur la Feuille de route (double clic gauche) et ensuite un clic droit et en sélectionnant "Placer le capuchon à la région centre." Avant d'utiliser le laser infrarouge de capture, viser et ajuster pour la force. Placez le bouchon dans une région de la lame loin de tissu. Sur la barre d'outils Capture Laser, sélectionnez "Activer". Réglez la puissance (3-100 mW), Pulse (100-1000000 μ; Sec) et # Résultats du laser. Lancez le laser IR lorsque le capuchon est sur une partie de la lame sans tissu et vérifier pour voir si le laser fait fondre suffisamment la membrane de plafonnement des LCM. Note: Ceci est appelé mouillage qui est en train de fondre la membrane de polymère sur le bouchon afin qu'il en contact avec la lame de verre. Mouillage suffisante est visible comme un anneau sombre fusionné à la diapositive avec le centre de l'anneau clair (voir la figure 4 pour des exemples de fusion suffisante et insuffisante). Si mouillage ne est pas suffisant, régler la puissance et le pouls, et le feu de tester à nouveau jusqu'à ce que cet objectif est atteint. En outre, plusieurs feux du laser peuvent également être utilisés. Lorsque l'intensité du laser IR est réglé, faites un clic droit et sélectionnez "laser Capture est ici" pour viser le laser. NOTE: Cette étape indique à l'ordinateur où le laser de capture IR vise à du tissu. Cette étape de viser le laser est critique et doit être répétée chaque fois que le bouchon est déplacé ou l'objectif est modifié. </ol> 5. Microdissection laser de dopamine neurones individuels hors des lames de silane-prep Déplacer vers la région d'intérêt pour capturer les cellules. REMARQUE: L'exemple d'isoler les neurones dopaminergiques est montré ici. Pour capturer des cellules individuelles hors d'une lame de Silane-prep, sélectionnez l'onglet "LCM" puis sur l'icône «point unique» dans la barre d'outil de microdissection. Dans la barre d'outils Microscope, utilisez l'onglet "Shutter" pour basculer entre la fluorescence et du champ lumineux avec filtres fluorescents onglets pour choisir les filtres appropriés et d'utiliser les onglets objectifs pour changer le grossissement. Une fois les cellules d'intérêt sont visibles dans la fenêtre vidéo en direct, ajustez la taille du point utilisé pour marquer les cellules d'intérêt à la taille approximative des cellules. Pour ce faire, cliquez sur l'onglet Spot sur la barre d'outils Capture Laser puis en cliquant sur un côté d'une cellule marquée, suivie en cliquant sur le côté opposé. NOTE: Ce calcule ladiamètre de la tache et affiche la valeur. Marquez les cellules d'intérêt en cliquant sur eux pendant que l'icône "point unique" est sélectionné. Pour ce faire, pour placer un marqueur de place sur chaque cellule. Ici, le filtre bleu et l'objectif 10X sont utilisés pour visualiser les neurones dopaminergiques. Retest et viser le laser infrarouge sur le bouchon où il n'y a pas les tissus sous comme décrit dans les étapes 4,9 et 4,10. Une fois que les cellules sont marquées, sélectionnez l'option "Go – coupe et capture" onglet sur la barre d'outils de microdissection laser et infrarouge se déclenche automatiquement les cellules du tout marqués sélectionnés. En outre, si nécessaire, tirer le laser IR manuellement à tout point d'intérêt (figure 5D). Déplacez le bouchon loin de la section et sur une région ouverte de la glissière de vérifier si les cellules ont été capturés sur le capuchon de LCM. Se assurer que les cellules d'intérêt sont éliminés de la glissière (figure 5B, E) et fixées à la calotte LCM (figure 5C, F). e de documentsest un processus en cliquant sur l'onglet "Capture d'image" dans Microscope barre d'outils. Lorsque vous avez terminé la collecte de tissus, enlever le bouchon par un clic droit sur le capuchon et sélectionnez "Déplacer vers" puis "Décharger". 6. Laser capture de dopamine neurones individuels hors du PEN Membrane Slides Pour capturer des cellules individuelles hors du PEN diapositives de la membrane en utilisant à la fois les lasers IR et UV, sélectionner "Couper et Capture" onglet dans la barre d'outil de microdissection. Sélectionnez l'onglet «point unique» pour marquer les cellules d'intérêt. Utilisez l'onglet «ligne Couper" pour décrire chaque cellule. Veillez à tester le laser IR comme décrit dans l'étape 4.9 et 4.10 et tester le laser UV pour déterminer l'intensité minimale nécessaire de couper pensé que le PEN membrane et tissus (Figure 4 et 5) Sélectionnez "Capture et Cut" onglet sur la barre d'outils de microdissection. Lors de la collecte des cellules individuelles en utilisant cette technique, êtreAssurez-vous de tirer le laser IR en premier, suivi par le laser UV que ces petits morceaux peuvent être perdues si elles sont découpées avant d'être fixé sur le bouchon de LCM. REMARQUE: Ce processus peut également être effectuée manuellement par le tir du laser IR à un point d'intérêt et les cellules décrit individuellement avec le laser UV. Après avoir recueilli les cellules d'intérêt, déplacer le bouchon du LCM comme décrit ci-dessus à l'étape 5.7 pour déterminer si les cellules ont été retirées et fixées au couvercle (figure 6). Lorsque vous avez terminé la collecte de tissus, retirez le bouchon en cliquant droit sur le capuchon et en sélectionnant "Déplacer vers" puis "Décharger". 7. Saisir l'tegmentale ventrale zone de diapositives Silane-Prep Pour identifier la région d'intérêt, utilisez la diapositive transformés pour l'immunohistochimie. NOTE: Pour cette démonstration l'aire tegmentale ventrale est isolé (figure 7A). Chargez une casquette de LCM et tester les lasers comme dans l'étapes 4.9 et 4.10. NOTE: En règle générale, un bonnet de LCM Macro est utilisé, mais un plafond de HS peut également être utilisé (voir la figure 8). Pour isoler une région de tissu (ce est à dire, l'aire tegmentale ventrale) de la glissière de Silane-prep, sélectionnez l'onglet "LCM" dans la barre d'outil de microdissection, puis sélectionnez l'onglet "polygone extérieur». Décrire la région d'intérêt dans la fenêtre vidéo en direct. Selon la taille de la zone de collecte, de décrire la région d'intérêt à faible grossissement (objectif 2x). Pour la collecte, cependant, l'instrument utilise l'objectif 10X donc ajuster et viser le laser infrarouge sous l'objectif 10X avant de capturer. Sélectionnez l'option "Go – la capture et la coupe" onglet dans la barre d'outil de microdissection. REMARQUE: L'ordinateur se déclenche automatiquement le laser infrarouge à travers l'ensemble de la zone sélectionnée (Figure 7F, I). Si la membrane de LCM n'a pas été suffisamment fondu dans toute la région, le laser peut être tiré hommesivement ou l'ensemble du processus répété. Déplacez le bouchon de LCM hors du tissu pour déterminer la façon dont le tissu a été prélevé. REMARQUE: On passe en utilisant cette méthode laisse généralement derrière une partie du tissu sur le chariot (Voir Figure7G). Si cela se produit, répéter la sélection et de capturer étape ci-dessus. La répétition de cette étape peut augmenter la quantité de tissu prélevé (figure 7J). Lorsque vous avez terminé la collecte de tissus, décharger le bouchon en cliquant droit sur le capuchon et en sélectionnant "Déplacer vers" puis "Décharger". 8. Saisir l'tegmentale ventrale zone de PEN Membrane Slides Utiliser le coulisseau traité pour l'immunohistochimie comme guide pour sélectionner la région d'intérêt à partir du tissu sur la lame de membrane PEN comme ci-dessus. Sélectionnez l'onglet "Couper et Capture" dans la barre d'outil de microdissection. Sélectionnez l'onglet "Couper Line" et de définir la région d'intérêt en utilisant le immunohistocheMistry étiqueté diapositive comme un guide. NOTE: Le programme va automatiquement ajouter des taches pour le laser IR pour fixer le tissu à la coiffe. Utilisez l'onglet «point unique» pour ajouter des points supplémentaires pour mieux sécuriser le tissu à la coiffe. Sous l'objectif, le feu de test 10X et viser l'IR et UV laser comme décrit dans 4.9 et 4.10. Vérifier que le laser UV peut pénétrer la membrane sur la lame et que cette découpe correspond à l'emplacement sur l'écran d'ordinateur. Utiliser une résistance au laser UV qui est juste suffisante pour couper la membrane et le tissu mais ne endommage pas le tissu (Figure 5). Sélectionnez l'option "Go – la capture et la coupe" onglet dans la barre d'outil de microdissection. REMARQUE: L'ordinateur se déclenche automatiquement le laser infrarouge à tous les points marqués dans le tissu pour le fixer au bouchon puis le feu le laser UV pour réduire la diapositive de la membrane PEN et de tissus (Figure 7C). Taches fondus IR supplémentaires peuvent être nécessaires pour fixer adéquatement la TISpoursuivre au bouchon de LCM, qui peut également être ajoutée manuellement. Déplacer le capuchon de LCM hors du tissu afin de déterminer si le tissu a été retiré de la section (Figure 7C) et fixé à la coiffe (figure 7C). Lorsque vous avez terminé la collecte de tissus, de retirer le bouchon, un clic droit sur le capuchon et sélectionnez "Déplacer vers" puis "Décharger". 9. Isolement de l'ARN Pour recueillir l'ARN à partir des cellules ou du tissu capturées, incuber la membrane de bouchon de LCM dans un tampon de lyse d'ARN pendant 30 min à 37 ° C. NOTE: Pour les capsules TR, un adaptateur est disponible qui permet l'utilisation de seulement 10 pl de tampon de lyse sur le capuchon et se attache à un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Les bouchons macro nécessitent 50 ul de tampon de lyse et se fixe directement à un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Après incubation, faire tourner le tampon de lyse dans le tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Pour assurer une lyse complète des cellules otissu r, décoller la membrane de plafonnement des LCM du capuchon et le placer dans le tampon de lyse. Pour tester l'intégrité de l'ARN, l'utilisation de l'ARN isolé à partir du tissu restant sur la lame après LCM pour mesurer l'intégrité de l'ARN. NOTE: En raison de l'ARN limitée de l'échantillon obtenu avec LCM, il ne est généralement pas pratique pour tester l'intégrité de l'ARN sur LCM ARN isolé, cependant, de l'ARN du tissu restant fournit un bon indicateur d'une dégradation de l'ARN en raison de la fixation, l'immunohistochimie et l'heure pendant la LCM procédure.

Representative Results

La micrographie sur les figures 6 et 7 montrent des capacités pour l'isolement des neurones dopaminergiques individuels. La résolution anatomique actuel est d'environ 5 à 10 um comme la plus petite taille de la tache qui peut être produit régulièrement sur le LCM bouchons pour isoler une cellule. La seule limitation pour l'isolement de types cellulaires spécifiques est la possibilité de visualiser les cellules. Bien que LCM est capable d'isoler les neurones dopaminergiques individuels, la contamination des parties de cellules non marquées adjacentes se produit le plus probable. Par conséquent, l'échantillon final est un concentré collecte des neurones dopaminergiques, et non pas une population pure de neurones dopaminergiques. Cette technologie est aussi capable d'isoler de petites zones de tissu tels que des noyaux ou des régions discrètes dans le cerveau, comme indiqué à l'isolement de l'aire tegmentale ventrale. Publications antérieures ont démontré cette utilisation dans les tissus du cerveau ainsi que pour isoler le tissu pathologique du tissu normal 5,11. <pclass > Parce que l'utilisation la plus courante de cellules et de tissus isolés en utilisant LCM est l'analyse de l'ARN, les procédures présentées ont été optimisés pour préserver l'intégrité de l'ARN. Afin de déterminer la qualité de l'ARN qui est resté suivant LCM, l'ARN a été isolé en utilisant des colonnes à base de silice de rotation, à partir de tissu sur les diapositives suivantes LCM, soit après la tyrosine rapide procédure d'immunohistochimie fluorescente hydroxylase ou fixation dans l'acétone. la qualité de l'ARN a été mesurée et comparée à des valeurs de l'ARN à partir d'ARN disponible dans le commerce du cerveau entier (figure 9). la qualité de l'ARN a été réduit dans les échantillons d'ARN provenant de tissus utilisés pour LCM avec intégrité plus faible après l'immunohistochimie (RIN pas disponible), suivie par de l'acétone fixation (RIN 2,6) par rapport à l'ARN de cerveau entier (RIN 8,2) comme on peut le voir par une réduction relative de hauteur du pic de l'ARNr S28 par rapport au pic S18. Cependant, l'ARN a maintenu les bandes 18S et 28S et l'expression du gène peut être mesurée en utilisant Q-PCR. <p class= "Jove_content"> Pour mesurer la quantité d'ARN obtenu à partir de neurones acquises via LCM, les neurones dopaminergiques (50, 100 et 200 neurones dopaminergiques) ont été isolés à partir de l'aire tegmentale ventrale de lames de Silane-Prep. L'ARN a été isolé en utilisant des colonnes à base de silice de spin et la quantité d'ARN a été mesurée. Sur la base de la courbe d'étalonnage généré, un total de 17,3, 24,8 et 50,9 pg pg / pl a été isolé à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques, respectivement (figure 10A). Pour mesurer la quantité d'ARN par Q-PCR, une gamme de concentrations d'ARN de cerveau et de l'ARN entier à partir des neurones dopaminergiques a été transcrit de manière inverse et le gène de la β-actine a été mesurée en utilisant Q-PCR comme décrit précédemment 5. Sur la base de ces mesures, une concentration de 3,55, 6,82 et 20,58 pg / pl a été calculée à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques, respectivement (figure 10B). Pour montrer comment l'isolement des neurones dopaminergiques compare à l'isolement de l'ensemble du vaire tegmentale entral avec LCM, des gènes spécifiques des neurones dopaminergiques (Nurr1, la tyrosine hydroxylase, et transporteur de la dopamine) ont été mesurés par Q-PCR dans ces deux types d'échantillons différents et on les compare à l'expression de la β-actine (figure 11). Etant donné que des valeurs inférieures t C sont générés avec une concentration plus élevée du gène d'intérêt, une diminution de l'Ac t indique une expression accrue des gènes de neurones dopamine par rapport au β-actine. Ceci démontre comment l'isolement des neurones dopaminergiques individuels concentre l'expression de gènes spécifiques des neurones dopaminergiques. Dans les échantillons d'aire tegmentale ventrale, des gènes spécifiques dopamine de neurones sont dilués comme d'autres cellules (neurones non dopaminergiques et les cellules gliales) seront également collectées qui expriment β-actine, mais ne expriment pas les gènes de neurones dopaminergiques. <strong> Figure 1. capture laser à l'aide du laser infrarouge (IR) de capture. Le petit bouchon en plastique LCM a une membrane sur le fond qui est placé sur le dessus du tissu monté sur une lame de verre (étape 1). Lorsque le tissu ou la cellule d'intérêt est identifié, un laser IR de capture est déclenché par l'intermédiaire du bouchon de LCM pour faire fondre une petite fossette dans la membrane sur le tissu / cellule sous-jacente (étape 2). Lorsque le capuchon est enlevé de LCM, le tissu est retiré de la lame de microscope et reste attachée à la capsule de LCM. Figure 2. capture laser en utilisant l'infrarouge (IR) laser de capture et l'ultraviolet (UV) laser de découpage. Pour obtenir de plus grandes zones de tissu ou faciliter la récupération des cellules en utilisant le laser UV, le tissu est monté sur un coulisseau avec une membrane relié à la coulisse le long de l'angle extérieur (PEN coulisse de la membrane). Le bouchon de LCM est placé sur til tissu et le laser IR de capture est utilisé pour faire fondre la membrane de couvercle et fixer le tissu sur le capuchon d'LCM (étape 1 et 2). Le laser de coupe UV est ensuite utilisé pour couper à travers la membrane de la lame et le tissu (étape 3 et 4) de sorte que lorsque le capuchon est retiré du tissu est prélevé à partir de la diapositive et reste sur le capuchon de LCM (étape 5). Figure 3. La Microdissection laser Système Road Map. Ce système de microdissection par capture laser a l'espace pour trois lames à la fois. Lorsque les diapositives sont chargées dans le microscope, faible grossissement Carte routière images pour chaque diapositive sont générés. Sélection d'une zone de l'image de feuille de route se déplace la fenêtre d'image en direct à cette région. Pour des fins de démonstration, du mésencéphale de la souris a été sectionnée en 10 um section sur trois diapositives. La première diapositive a été étiqueté pour la tyrosine hydroxylase immunoreactivité en utilisant de la diaminobenzidine comme chromogène un (A). Les sections ont été installés sur des diapositives Silane-Prep (B) ou des diapositives de la membrane PEN (C). Ces deux diapositives ont été marqués en utilisant la tyrosine hydroxylase immunohistochimie fluorescente rapide. Flèches dans (C) indiquent l'attachement de la membrane PEN à la lame de verre. Aucun tissu extérieur de cette frontière peut être recueilli avec LCM. Figure 4. En utilisant le laser de capture IR. Le laser de capture d'IR est utilisé pour faire fondre le bouchon de membrane de LCM pour fixer le tissu sur le capuchon d'LCM et le retirer du reste du tissu. Le laser de capture IR doit être à une force suffisante pour faire fondre le bouchon de membrane suffisamment LCM pour contacter la lame de verre et le tissu sous-jacent. L'image ci-dessus montre lorsque le laser était insuffisante pour faire fondre la membraneau coulisseau (deux taches de gauche). Lorsque la membrane fondue touche la lame de verre, un contour noir épais peut être observée (spot à droite). L'intensité du laser peut être ajustée en changeant la puissance (de 3 à 100 mW), Impulsion (us 100-1,000,000) et # Résultats du laser. En outre, répété tir du laser infrarouge au même endroit peut aussi fondre davantage la membrane. Le but du laser IR doit être ajustée chaque fois que le capuchon est déplacé LCM ou lorsque l'objectif est changé. Barre d'échelle = 100 um. Figure 5. Utilisation de la découpe au laser UV. Le laser UV de coupe est utilisé pour couper à travers la membrane et le tissu PEN. Avant d'utiliser l'intensité minimale nécessaire pour couper à travers la membrane et le tissu doit être de déterminer depuis le laser UV peut endommager les tissus. Ci-dessus, les trois points (flèches) de différentes intensités laser UV sont présentés avec le taille suffisante pour 10 sections um, le milieu de terrain pour les sections plus épaisses et au bon endroit démontrant une intensité laser UV qui est trop élevé place gauche. Barre d'échelle = 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Les neurones dopaminergiques Figure 6. L'isolement direct de la tyrosine hydroxylase neurones immunoréactifs à l'aide du laser IR. Sont indiqués après un marquage fluorescent rapide pour la tyrosine hydroxylase (A). Lorsque le laser infrarouge est tiré fusion de la membrane de bouchon de LCM sur ces neurones (D), l'enlèvement du capuchon capte ces cellules hors de la glissière (B, E). Ces neurones peuvent alors être visualisés comme attaché au capuchon de LCM (C, F). Barre d'échelle = 250 um.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 7. L'isolement direct de la tyrosine hydroxylase neurones immunoréactifs à partir de lames de la membrane PEN utilisant les lasers IR et UV. Tyrosine hydroxylase neurones marqués sont présentés ci-dessus (A). Ces neurones peuvent être fixés au plafond de LCM en utilisant le laser IR et découpées dans la coulisse de PEN membrane en utilisant le laser UV (B). Barre d'échelle = 250 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 8. indirect isolement de l'aire tegmentale ventrale en utilisant la tyrosine hydroxylase immunoréactivité. L'emplacement des neurones dopaminergiques dans l'aire tegmentale ventrale a été visualisée dans une section en utilisant des techniques immunohistochimiques standard (A et E). Cette section intitulée immunohistochimie a été utilisée comme un modèle pour localiser l'aire tegmentale ventrale dans les sections adjacentes non colorées (B et F). En utilisant le laser UV, l'aire tegmentale ventrale a été attaché au capuchon de LCM avec le laser IR et coupé de la lame avec le laser UV (C et D) et est représentée fixée à un plafond HS LCM (D). La région tegmentale ventrale isolé à partir de diapositives Silane-prep en utilisant seulement le laser infrarouge est également montré attaché à un plafond Macro (FK). A noter que plus d'une tentative a été nécessaire pour recueillir la majeure partie du tissu à partir de cette région (Comparer G et J). Barre d'échelle = 500 um.pload / 52336 / 52336fig8large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure qualité 9. ARN. Électrophérogrammes représentatifs et les images de gel associés disponibles dans le commerce ARN totaux du cerveau (A) et l'ARN isolé à partir de sections après fixation à l'acétone et LCM (B) ou fluorescent immunohistochimie rapide de la tyrosine hydroxylase et LCM (C). Bien que la qualité de l'ARN a été réduite dans les sections traitées pour l'immunohistochimie, par rapport à l'ARN de cerveau entier, les électrophérogrammes montrent l'ARN intact essentiellement basée sur la présence des pics ARNr S18 et S28. Concentration d'ARN du cerveau entier était 6,487 pg / ul avec un RIN de 8,2. Acétone concentration d'ARN de tissu fixé était 5,036 pg / ul avec un RIN de 2,6. ARN obtenu après immunohistochimie h insérer une concentration de 4,474 pg / pl et RIN était pas disponible. Figure 10. quantité d'ARN. Pour déterminer la quantité d'ARN dans les neurones obtenus avec LCM, une courbe standard de la concentration d'ARN a été produit en utilisant un fluorospectromètre et Q-PCR. Pour les mesures de fluorospectromètre (A), la grande graphique montre la gamme supérieure des montants d'ARN et le petit graphique montre la sensibilité de ce dosage jusqu'à 10 pg / pl. Les concentrations d'ARN obtenus à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques a été de 17,3, 24,8 et 50,9 pg / pl, respectivement. Utilisation de Q-PCR pour mesurer des quantités d'ARN (B), les concentrations d'ARN obtenus à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques a été de 3,55, 6,82 et 20,58 pg / pl, respectivement. es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/> Figure 11. Concentration de gènes spécifiques de la dopamine des neurones à l'isolement des neurones dopaminergiques individuels. La différence de C t (Ac t) entre les gènes de la dopamine des neurones spécifiques (Nurr1, la tyrosine hydroxylase, et transporteur de la dopamine) et de β-actine dans des échantillons de neurones dopaminergiques dans l'aire tegmentale ventrale isolé avec LCM par rapport à l'expression dans les dissections de toute la région tegmentale ventrale sont indiqués. Comme T valeurs inférieures C sont générés avec une concentration plus élevée du gène d'intérêt, une diminution de l'Ac t indique une expression accrue de gènes de la dopamine des neurones par rapport à β-actine en tant que d'autres cellules (neurones non dopaminergiques et les cellules gliales) volonté recueillir dans les échantillons d'aire tegmentale ventrale qui expriment l'actine-β mais ne expriment pas les gènes de neurones dopaminergiques.

Discussion

LCM est une technique puissante pour la dissection des populations distinctes de cellules ou de tissu à partir de régions de coupes de tissus sur une lame de microscope et l'isolation ultérieure de l'ARN, micro-ARN, l'ADN et les protéines. L'utilisation de LCM en combinaison avec l'analyse en utilisant des technologies à haut débit tels que la puce à ADN, suivant le séquençage de l'ARN de production, l'analyse épigénétique de l'ADN et la protéomique est de plus en plus fréquent que la sensibilité de ces techniques se améliore et la quantité de matériau de départ nécessaire est réduite 8-12. Avec LCM, une meilleure résolution anatomique est réalisé pour un échantillon, et à la compréhension des mesures en aval de ces échantillons est grandement améliorée. Une mise en garde avec LCM est qu'elle fournit un échantillon concentré de cellules d'intérêt, mais pas nécessairement une population pure de cellules. Les limites de la précision signifie qu'il y aura une certaine contamination du tissu adjacent. Cependant, cette technique ne se concentre les cellules d'intérêtpour minimiser les effets associés à des cellules et des tissus environnants et de maximiser les effets expérimentaux sur les cellules d'intérêt.

Direct par rapport indirect immunohistochimie

Depuis LCM est actuellement utilisée principalement pour la séparation et la mesure de l'ARN, l'ARN intact maintien est un critère très important. Le maintien de l'intégrité de l'ARN est la raison principale derrière l'utilisation de l'immunohistochimie indirecte pour guider la dissection des tissus qui élimine la nécessité de colorer directement le tissu qui peut dégrader l'ARN (figure 10). Lorsque la question expérimental, cependant, nécessite l'isolement d'une population spécifique de cellules, telles que les neurones dopaminergiques, immunohistochimie fluorescente directe ne est nécessaire. L'utilisation d'un protocole rapide d'étiquetage immunohistochimie peut minimiser la dégradation de l'ARN au cours de la procédure. Les temps d'incubation courts sont dues à l'utilisation de concentrations élevées d'anticorps anti primaire et secondaireorganismes, les concentrations qui sont autour de 10 à 20 fois supérieures à ce qui est nécessaire pour l'immunohistochimie classique avec une incubation de 2 h. Si toutefois, des temps d'incubation plus longues sont nécessaires, Brown et Smith utilisés tampons élevées de sel pour inhiber la dégradation de l'ARN et obtenir une bonne ARN de qualité avec des temps d'incubation longs (jusqu'à 20 h) 13. Cette approche peut également être utilisé se il ya beaucoup de temps nécessaire entre l'étiquetage du tissu et de l'accès à un système de LCM.

Choix de diapositives – membrane PEN, Silane-prep et lames de verre non couchés

L'utilisation de lames de verre non couchés pour LCM ont été signalés 14. Dans notre laboratoire, lames de Silane-prep se sont révélés être un choix optimal, que ce revêtement se fixe suffisamment le tissu pour le coulisseau pour l'immunohistochimie sans perte de tissu mais permet encore pour la fixation du tissu à des capuchons LCM et le retrait de la lame . Lames de verre non couchés onta montré une certaine perte de tissu avec la procédure d'immunohistochimie. Si immunohistochimie indirecte est utilisée, cependant, la rétention de tissu devient moins un problème. Avec déshydratation appropriée, les cellules de capture ou de tissu hors de diapositives Silane-Prep n'a pas été un problème. Chacune des différentes approches de neurones isolement ou régions du cerveau décrites dans ce document présente des avantages et des inconvénients. Pour l'isolement des neurones dopaminergiques individuels, l'utilisation de lames de Silane-prep présente l'avantage d'une meilleure optique et est moins coûteux que les lames de la membrane PEN. L'inconvénient est que les cellules parfois capture peut être difficile se il ya déshydratation insuffisante (voir ci-dessous) et de certains tissus peut être laissé sur la diapositive. L'avantage des diapositives membranes PEN est que l'utilisation de la combinaison du laser UV et IR laser assure que les neurones dopaminergiques sont recueillies. Le défaut de recueillir des cellules de la membrane coulisse un PEN presque ne se produit jamais, car elle est moins dépendante de la déshydratation que les lames de verre. Une avantage supplémentaire est que le laser UV peut être utilisée pour rapprocher plus étroitement la forme des neurones d'intérêt, par rapport à un cercle de capture hors de neurones des lames de verre avec le laser IR. Pour l'isolement des régions de tissu, les diapositives de la membrane PEN sont de loin supérieures et justifient le coût supplémentaire. Cette approche aboutit à l'élimination complète de tous les tissus découper sur la membrane, est beaucoup plus rapide que la capture d'une grande zone de tissu en utilisant le laser IR seul et coupes de tissus plus épais peuvent être recueillis. En utilisant seulement le laser IR nécessite que la membrane de bouchon de LCM soit complètement fondu au-dessus de la zone de tissu ensemble. En outre, la collecte incomplet du tissu est typique et nécessite généralement plusieurs tentatives. Bien que cela prend plus que le tissu isolant de la lame de la membrane PEN, si le tissu disponible est déjà sur une lame de verre ou d'un laser UV ne est pas disponible, ce est une option viable, car la plupart des tissus peuvent être collectées (Figure 8J).

"> Les étapes critiques ove_content

Les incubations d'éthanol 100% sont une des étapes les plus importantes. Afin de recueillir les cellules à partir de diapositives Silane-Prep déshydratation complète du tissu est requis. Par conséquent, toute l'eau ne est pas retiré, qui est associé principalement avec l'incubation de l'éthanol à 100%, aura un impact sur la capacité de prélever des cellules à partir des diapositives. Afin de répondre à cette question, changer fréquemment les solutions d'éthanol 100%, car l'absorption de l'eau de l'air ou le transfert de lavage étapes précédentes peuvent affecter la déshydratation. En outre, les tamis moléculaires sont utilisés pour absorber toute contamination de l'eau. Le système de LCM devrait idéalement être situé dans une petite chambre avec un déshumidificateur pour maintenir des conditions de faible humidité.

Sections de bonnes cryostat sont essentielles pour LCM bon. Les articles doivent être à plat avec des plis dans le tissu minimisé. Plis dans le tissu va augmenter la distance entre le capuchon de LCM et l'empêcher d'entrer en contact til tissulaire. Il devient alors difficile à fondre suffisamment le capuchon à membrane sur le tissu. Pour les lames de verre, généralement l'épaisseur de coupe doit être compris entre 6 et 12 um. Sections plus épaisses peuvent être capturés avec les diapositives de la membrane PEN.

LCM offre une capacité technique de faire dissections très précises de tissus et de cellules à partir des lames de microscope. Ceci augmente considérablement la résolution d'une analyse complémentaire par rapport à la dissection brut des morceaux de tissu. Bien que, LCM peut prendre du temps et de main-d'œuvre, il ne nécessite pas une formation approfondie ou d'expertise et, lorsqu'il est couplé avec d'autres technologies à haut débit, peut grandement améliorer la compréhension d'un processus biologique lorsque les cellules discrètes ou régions anatomiques sont utilisés.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 – 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Numer  Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System Life Technologies, Grand Island, NY Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0211
CapSure HS LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0213
PEN Membrane slides Life Technologies, Grand Island, NY s4651
Silane prep-slides Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S4651
95% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7148
100% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023
Rnase Free Triton Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8787
Molecular Sieve EDM Millipore, Billerica, MA MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody EDM Millipore, Billerica, MA Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Life Technologies, Grand Island, NY A-11008
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA G2939AA
Stratagene MX 3005P Agilent Technologies, Santa Clara, CA 401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen Life Technologies, Grand Island, NY R11490
RNaseZap Life Technologies, Grand Island, NY AM9780
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References

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Kummari, E., Guo-Ross, S. X., Eells, J. B. Laser Capture Microdissection – A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area. J. Vis. Exp. (96), e52336, doi:10.3791/52336 (2015).
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