JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

И что нельзя делать крио-электронной микроскопии: учебник по пробоподготовки и высокое качество сбора данных для высокомолекулярных 3D реконструкции

Published: January 09, 2015
doi:
10.3791/52311
,
1Department of Physiology and Biophysics,Virginia Commonwealth University

Summary

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Abstract

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.

The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.

The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Introduction

Цель cryoEM является получение электронно-микроскопических изображений макромолекул на их родном гидратированном состоянии. В силу вложения макромолекулы в остеклованных воды, замороженные увлажненной образец можно сразу же ввел и визуализируется в приборе ПЭМ. Витрификация, методом флэш морозильной (10000 ° С / сек), замерзает образец без кристаллизации воды и гарантирует, что молекулярные перегруппировки при замораживании незначительны. Избыток рассеяния электронов от образца по отношению к окружающей буфера обеспечивает небольшой, но достаточный контраст, чтобы увидеть макромолекулы в отсутствие какого-либо пятна 1. Компьютерной обработки изображений могут быть использованы для воссоздания 3D структуру макромолекулы. Большие макромолекулы в диапазоне ~ 500 kDa- нескольких МДа являются идеальными образцами для cryoEM (на сумму свыше 80% от электронной микроскопии банка данных (EMDB) Записи); они включают в себя белки, белковые комплексы, белок-нуклеиновая кислота, грomplexes, и мембранные белки встроены в бислой. Эти макромолекулы имеют меньше шансов быть кристаллизован (с менее чем 2% записей в базе данных PDB), но это часто бывает, что мелкие куски, решаемые с помощью рентгеновской кристаллографии или ЯМР может быть закреплен в 3D оболочки, созданной cryoEM. С другой стороны, некоторые из самых больших структур, решаемых cryoEM могут быть идентифицированы в полном клетку шлифа ТЕА 2. Таким образом, cryoEM эффективно устраняет размера и разрешения разрыв между субклеточном и атомных структур.

CryoEM лучше отражает нативной структуры макромолекулы, чем более классическим методом негативного окрашивания (NS), где макромолекулы обезвоженной и окружен слоем тяжелых металлов пятно которой область пятна исключения создает сильно контрастирует "негативный" образ 3. В обоих случаях электронный пучок производит 2D проекции изображения макромолекул, называемых частиц, где SHape зависит от ориентации макромолекулы по отношению к электронным лучом. Многие частицы, по меньшей мере, ~ 1000 и без верхнего предела, могут быть проанализированы на компьютере с "анализа одной частицы '(SPA) программного обеспечения, чтобы увеличить отношение сигнал-шум (SNR), хотя усреднения, и найти пространственные параметры ориентации частицы необходимо воссоздать макромолекулы в 3D структуру, проекционный 4-7. NS, с высоким ОСШ, используется для предварительного определения характеристик образцов и генерировать De Novo 3D-реконструкция; его разрешение редко превышает 20 А, что, введенной обезвоживания и размера тяжелых металлов зерна. В общем, для cryoEM 3D структурного определения, 3D-реконструкция с низким разрешением сначала получают от NS, а затем cryoEM используется для уточнения этого низкого разрешения первоначальный карту для дальнейшего изучения макромолекулы в своем родном гидратированном состоянии, чтобы увидеть его внутреннюю структуру, и повысить его разрешение. Нетте, что в случае искажается модель NS (самый распространенный пример выравнивания в результате обезвоживания 8) и частицы cryoEM имели низкую SNR, то искажение может нести в модели cryoEM (артефакта модель смещении, который является общим в низком SNR Наборы данных 9). Структурная деформация может привести к несоответствию между НШ и cryoEM сырья частицами и между сырья частиц cryoEM и соответствующих проекций 3D модели, перпендикулярном направлении уплощения. Модель смещения может решить сам по себе, как 3D-модель подвергается последовательных циклов уточнения. Если это не происходит, что будет обнаружено как отсутствие соответствия между сырья частиц cryoEM и соответствующих проекций 3D-модели, а затем заново модель должна быть построена по данным cryoEM. Хороший подход может быть использование угловой алгоритм реконституции 10, который может дать несколько возможных 3D томов, а затем использовать NS 3D-модель, чтобы выбрать лучший из возможных моделей cryoEMчто будет доработан 11. Даже лучшая стратегия заключается в увеличении SNR набора данных cryoEM (см специальный раздел в обсуждении).

Биохимический качество очищенной макромолекулы имеет максимальную влияние на конечный результат. Макромолекулы, очищают от тканей или выражены в гетерологичных системах, должен иметь высокую степень чистоты и быть конструктивно неповрежденным. Это не должно ни образуют агрегаты не должно разбить. Чтобы определить конкретную конформацию, условия приготовления должны способствовать равномерное конформационные состояния. Для изучения комплексов, оптимально, что их к = находится в диапазоне нМ, в противном случае фиксаторы были успешно использованы для стабилизации более низким сродством взаимодействия 12,13.

Необработанные cryoEM изображения позволяют получать ценную информацию о размерах, общие контуры, агрегатное состояние / мультимеризацию, однородности и внутреннюю структуру macromolecuле. Тем не менее потенциал этой техники значительно усиливается с обработкой изображений. 3D структура показывает общую архитектуру макромолекулы, 3D расположение лигандов и подразделений, конформационных изменений, а также позволяет стыковку атомных структурах, определяемых с помощью рентгеновской кристаллографии или ЯМР. Количество информации в 3D реконструкции ступенчато увеличивается как разрешение увеличивается: в общем 15-20 резолюции А позволяет однозначно определять стыковку атомных структур, в 9-10 Å альфа-спиралей видны как стержней, на 5 Å можно различить бета-листы, а при разрешении 3,5 Å, и лучше это можно построить модель атома 14.

Возможность получения информативных изображений и 3D-реконструкции с использованием SPA от относительно малых количеств образца делают cryoEM привлекательным техники, а 3-5 мкл по меньшей мере 0,05 мг / мл достаточно, чтобы подготовить один ТЕА сетку. Минимальные инструментальные требованиядля cryoEM являются самодельные или коммерческой крио-поршень, электронный микроскоп с ультра высоким вакуумом, записи изображения СМИ и низких доз комплект, крио-держатель с его насосной станции, тлеющего разряда аппарата, и испаритель. Несущественные но в дальнейшем желательные характеристики на ТЕА являются CCD камера (присутствует во всех современных ПЭМ) или прямой электронный детектор, пистолет с полевой эмиссией (FEG), фильтрация энергии и высокая пропускная способность программного обеспечения сбора данных. Это программное обеспечение, в принципе, позволяет собирать десятки тысяч частиц в одной сессии cryoEM 15, однако возросшие потребности в хранении данных и последующее наблюдением потребность времени пост-обработки должны быть приняты во внимание. FEG в сочетании с функцией передачи контраста (CTF) коррекции лежит в основе большинства 3D реконструкции, которые достигли разрешением, достаточным для визуализации альфа-спирали. В тот момент, уровень разрешения также образец зависит от: достижение 10 Резолюция A реже для мембранных белков, тогда как, есливысокого порядка симметрии присутствует, то атомное разрешение более достижимой. Недавнее развитие прямых электронных детекторов позволило атомное разрешение даже для макромолекул с низким (4x) или без симметрии, где качество карт электронной плотности cryoEM соответствует этим происходит от рентгенографических данных 16,17.

Практические примеры, иллюстрирующие возможности метода приведены здесь в течение четырех важных видов макромолекул, где cryoEM имеет неизменную главную роль в их структурного определения. (Я) С их икосаэдра симметрии, что увеличивает набор данных по 60 раз, а их большой размер, что позволяет верующим и воспроизводимые выравнивание, структуры нескольких икосаэдрических вирусов были решены в ближайшее атомным резолюции cryoEM последующим SPA 18. Мы показываем пример класса икосаэдрических вирусов, тем адено-ассоциированные вирусы (AAVs), для которых почти атомные структуры по cryoEM и по cryoEM / рентгеновского HYсуществуют Брод методы 19,20. (II) макромолекул с спиральной структуры включают микротрубочек нитей и вирусы. Их повторяющиеся блоки вдоль оси спирали могут быть проанализированы с помощью более сложной версии SPA, адаптированной к спиральной конфигурации 21. В примере мы покажем, вирус табачной мозаики (ВТМ), РНК-вируса, который было решено атомным разрешением на cryoEM 22. (III) Большие растворимые белки были изучены подробно. Среди них, макромолекулы, образующие симметричные многомерные цилиндры представляют собой повторяющиеся архитектуру часто решается при разрешении субнанометровым 23,24. Здесь мы показываем, изображения ГМЦ, беспозвоночных переносчика кислорода, где гибрид молекулярная модель была создана с cryoEM / рентгеновской кристаллографии гибридных методов 25. (IV) Мембранные белки представляют собой важный класс белков; они составляют около 1/3 белков, кодируемых геном человека, но их трудно охарактеризовать структурно-за сложностей, связанных с TRansmembrane стабилизации домена 26, что составляет менее 1,5% от структур, решаемых любого структурного метода, вместе взятых. Роль cryoEM и 3D реконструкции в их структурного определения иллюстрируется с рецептором Рианодин (RyR), большой эукариотической внутриклеточного Ca 2+ канала важной в сокращении мышц и сигнализации мозга. Самое высокое разрешение cryoEM структуры на сегодняшний день, с разрешением 10 А, выявить вторичную структуру 27.

Protocol

1. Cryo-держатель Подготовка и обслуживание ПРИМЕЧАНИЕ: сухой насосная станция, состоящая из турбо насосной станции и одного или более холодных контроллеров этапе, в основном используется для трех целей: а) она является безопасным местом для хранения криогенных держатели, когда они не используются. Правильный способ для хранения держателей должен оставить их на станции под вакуумом. б) для испарения инея и влаги наращивание, которое происходит, когда жидкий азот удаляется из сосуда Дьюара и кончиком держателя крио подвергается; Это достигается с разминки цикла. с) регенерации цеолита осушитель, и достичь высокого вакуума в cryoholder сосудов Дьюара. Это необходимо для проведения постоянной температуры при выполнении крио электронной микроскопии. Разминка цикла. Вставьте держатель крио в одном из насосных портов насосной станции. Подключите один из эвакуационных трубок к выпускному металла под вакуумного клапана владельца. СделатьУбедитесь, что все вентили на станции (V1, V2, V3 и) и на держателе крио закрыты. Включите холодную контроллера стадии и подключить его к держателю через шнура управления. Включите выключатель питания турбо насосной станции. Начните вариант Разминка цикла в холодной контроллера на сцене. Когда вакуум в турбо насосной станции читает 10 -3 Торр и лучше, открыть клапан V2 бабочки, подождите, пока вакуум не стабилизируется, а затем откройте V1 дроссельную заслонку. Запустите разминки цикл около 30 мин, пока температура в держателе не является стабильной выше 20 ° C. Закрыть V1, а затем остановить цикл. Цеолит цикл. Запустите цеолита переключения между 4 ч и O / N Перед CryoEM сессии, и раз в неделю, если не используется. Начало вариант Цеолит цикла и выбрать необходимое время для достижения хорошего вакуума, в диапазоне 1-2 х 10 -4 Торр, и, таким образом долго удерживать. Когда вакуум достигает 10 -3Тор, откройте эвакуации Дьюара клапан, V3. Насосная станция будет эвакуировать линию к держателю; ждать, пока вакуум не стабилизируется. Откройте клапан на держателе крио. Когда цикл завершится, закройте клапаны в обратном порядке, в котором они были открыты: клапан на держателе, то V3, V2, и, наконец, V1. Выключите турбо насосной станции и холодный контроллер стадии, и отсоедините держатель крио от холода контроллера стадии, и турбо насосной станции. 2. Сетка Подготовка Очистка. Примечание: При использовании коммерческих дырявые сетки, рекомендуется, чтобы очистить их перед использованием, чтобы удалить любые остаточные полимер, который был использован в процессе изготовления. Для этого в стеклянную чашку Петри с 5 слоев фильтровальной бумаги, установленных в нижней части. Поместите сетки на фильтровальной бумаге с дырявым сторона углерода вверх. Используя стеклянную пипетку Пастера, смочите бумагу с несколькими каплями оF хлороформ вокруг сетей, пока они не начнете плавающим. Накройте чашку Петри с крышкой приоткрыта в вытяжном шкафу O / N. ПРИМЕЧАНИЕ: тонкий углеродный носитель (шаги 2.2-2.3) может быть опущена, как слой льда может быть непосредственно формируются через небольшие отверстия в дырявой углерода сетки. Использование пинцета, расщеплять кусок слюды, чтобы выставить две новые поверхности. Поместите новые открытые поверхности слюды лицевой стороной вверх на белом листе бумаги в чашке Петри. Поместите чашку Петри в колоколе углеродного испарителя. Начните последовательность насоса, пока вакуум не ниже 2 х 10 -6 Торр. Испаряться любые примеси на поверхности углеродного стержня, выполнить предварительную испарение с чашки Петри, покрытой. После этого воздух колпаком и снимите крышку с чашки Петри. Выполнение последовательности насоса, пока вакуум не ниже 10 -6 торр и пальто слюды с тонким слоем (~ 5 нм) углерода. Используйте средства защиты глаз во время углеродаиспарения. Контроля толщины углеродной пленки на полученной темноте на документе, который был помещен под слюды. Передача тонких углеродных ТЕА Grid. Вырезать 0,5 х 1 см кусок слюды, покрытой и плавать нагар на плоской поверхности фильтрованного деионизированной воды. Используйте оптический бумаге линзы, чтобы получить плоскую поверхность воды. Использование пинцета, поместить дырявый углерода сторону сетки в контакте с верхней поверхностью плавающего слоя углерода и забрать его. Повторите шаги 2.3.1 и 2.3.2 до тех пор, достаточное количество сеток не готовы. Тлеющего разряда. ПРИМЕЧАНИЕ: тлеющий разряд преобразует естественно гидрофобный слой углерода покрытия решеток в гидрофильной. Этот шаг является необязательным. Поместите сетки с углерода стороной вверх на 7,5 х 2,5 см стекло, покрытой парафильмом. Поместите его в камеру тлеющего разряда оборудования и замкнуть прострел. Насосколпак и тлеющего разряда в течение 20 сек при 25 мА и 7 х 10 -2 мбар. ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени светло-фиолетовый свечение становится видимым. Снимите стекло с сетками и использовать их в течение 1 ч, в противном случае, они должны быть свечение выписан снова. 3. Образец Окунитесь замораживание ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте защитные очки и подходящую обувь при использовании этого инструмента для защиты от жидких азота и этана брызг. Включите небольшим заморозки аппарата. Заполните увлажнитель резервуар с дистиллированной водой. Установите нужную температуру, относительную влажность и крутые условия для блоттинга время, тщательно силы и время адсорбции (22 ° C, 95%, 2 сек, 2 и 40 сек в примере, представленном здесь). Поместите новый блоттинга фильтровальную бумагу. Охлаждают этана контейнер вниз, заполнив наружный резервуар с жидким азотом до тех пор, стабильность не будет достигнута (около 10 мин). После того, как жидкий азот останавливается boilinг, поместить кончик трубки, поступающей из этана бака во внутренней камере и открыть клапан очень медленно. Liquefy этана во внутренней камере и заполнить его до 1 мм от верхней части. Избегайте замораживания этан. ВНИМАНИЕ: этан чрезвычайно огнеопасны и взрывоопасны. Убедитесь, что пинцетом выровнены в устройстве окунуться замерзания. Включите влажности. Загрузите сетку на пинцетом, и загрузить 3-5 мкл образца на поверхность углерода (скучно) сторону дырявой сеткой. Подождите образец адсорбироваться на сетке, и выполнения блоттинга для достижения тонкий слой жидкости. Вспышка замораживания сетки, погружая его в жидкий этан. Снимите пинцет-GRID узел из жидкой этан холдинга пинцет устойчиво, и передать его на внешнюю камеру с жидким азотом. Передача сетку с небольшой коробке сетки, погруженной в жидкий азот. Убедитесь в том, чтобы держать витрифицированном образца в жидком азоте в течение всего времени передачи или резервуараили к держателю крио. ПРИМЕЧАНИЕ: GRID коробки могут быть сохранены в большой емкости (35-50 л) жидким азотом сосуд Дьюара, по крайней мере, 1 год. Для удобного хранения они могут быть помещены в 50 мл Сокол трубки с двумя отверстиями в верхней и лески, прикрепленной к его крышкой, которая может быть вытащил изо рта сосуда Дьюара. 4. Передача крио-сетки для ТЕА Вставьте держатель крио в рабочую станцию ​​крио-передачи. Позаботьтесь, чтобы не повредить кончик держателя во время установки. Проверка на наличие небольших волокон и пыли на стержне и с уплотнительным кольцом держателя крио использованием лупы, если есть какие-либо удалить его с оптическим бумаги линзы. Заполните сосуд Дьюара владельца крио и рабочих станций сосуд с жидким азотом. Избегайте попадания жидкого азота с помощью захваченных воронку, которая поставляется вместе с рабочей станции. Подключите держатель крио-за холодной контроллера стадии для контроля температуры, и держать добавлением жидкого азота & #160;, пока температура не стабилизируется в пределах -194 ° С. Убедитесь, что уровень жидкого азота под уровнем вакуумного уплотнения и на рабочей станции судна и владельца крио Дьюара. Pre-охлаждать сетки пинцет, зажим кольцо и тупой конец клипа кольца инструмента на рабочей станции. Кроме предварительно охладить набор больших пинцета и отвертки в другом сосуде Дьюара с жидким азотом. Быстро перевести коробку сетки крио содержащий замороженных гидратированных сетки в жидком азоте в рабочую станцию ​​с использованием больших пинцета. Откройте сетки окна крио с помощью отвертки, взять замороженную гашеной сетки и поместить его в слот держателя образца. Поместите клип кольцо на верхней части сетки и аккуратно нажмите на него с тупым концом клипа кольца инструмента, пока он не будет прочно встал на место. Закройте крио-затвор. Снимите флажок инструменты и крио сетки с рабочей станции. Переместить весь станция с держателем и сетки с микроскопом консоли для того, чтобы миниMize время передачи сетки воздуха в помещении. Довершение ТЕА анти-загрязнитель с жидким азотом, который был ранее заполненной и охлаждается в течение по крайней мере 20 мин. Pre-наклоните столик микроскопа до -60 °. Примечание: Это сведет к минимуму потери жидкого азота в держатель вставляется в шлюз. Начинают предварительно насоса шлюза цикл на микроскопе. Убедитесь, что клапан в электронной пушки закрыт (особенно, если это FEG TEM). Подождите, последовательность шлюз до насоса до конца (около 2 минут), прежде чем вставлять держатель крио. ПРИМЕЧАНИЕ: Это указывает красного света на этапе их потушить. Вставьте держатель в шлюз и поверните его на 90 ° по часовой стрелке; подключения холодной стадии контроллера питания в держатель крио для контроля температуры. Подождите, пока красный свет не погаснет и вращаться как по сцену и держатель обратно в положение 0 °, чтобы вставить держатель в Hi ТЕА вGH вакуумная колонна. Убедитесь, что температура никогда не поднимается выше -160 ° C, чтобы избежать образования кристаллического льда. Заполните Дьюара владельца крио. Подождите 15 – 45 мин до обладатель не в тепловом равновесии и TEM вакуум восстановился до записи изображения. Если пузырьков в жидком азоте обнаружена, изменить уровень жидкости заполнения азот, или нежно коснуться булькающий происхождение ватным тампоном. 5. Низкие дозы Сбор данных ПРИМЕЧАНИЕ: техника сбора данных с низкой дозой используется, чтобы минимизировать ущерб электронного излучения на образец, ограничивая воздействие 20 электронов / A 2. Это достигается путем чередования трех конфигурациях: "Поиск", с низким увеличением (~ 5,000X) и широким полем зрения, "Фокус", с большим увеличением (~ 150,000X) и малым полем зрения, и «разоблачения», с желаемой конечной Магнификация и содержащий область интереса для записи. Бланк луч между режимами. Настройка ТЕА и программы с низкой дозой Уберите крио-затвор и открыть столбцов клапанов. Сосредоточьте на сцену и установить eucentric высоту (Z) с помощью альфа-воблер рок сцену ± 15 °. Отрегулируйте положение Z пока не наблюдается заметного движения в то время как этап качания. Активировать программу низкой дозы и выбрать детектор для каждого режима. В режиме экспозиции найти область сетки, которая не имеет углерод, отрегулируйте освещение за счет выбора оптимального конденсатора диафрагмы и точечный размер так, чтобы область, которая будет записана полностью освещена. Будьте уверены, чтобы распространить луч в направлении overcondensation. В режиме поиска, найти небольшую особенность, которая будет легко идентифицировать при большем увеличении. В режиме экспозиции, Центр эту функцию с помощью джойстика (ху контроллера этап). Начало в меньшем увеличении, если подвигЮр не находится в поле зрения. В режиме поиска, довести эту функцию в центре поля, используя доза ху управления низкие смещения изображения. Перейти в режим экспозиции и переместите объект вдоль наклона оси с помощью джойстика, пока он не выйдет из области должен быть записан (0,5 – 3 мкм). Перейти в режим сосредотачиваете функцию с помощью элементов управления ху смещения изображения. Начало в меньшем увеличении, если функция не в поле зрения. Держите луч с центром в любое время. Сбор данных Уберите крио-затвор и открыть столбцов клапанов. Активируйте программу с низкой дозой. В режиме поиска, выявления квадрата сетки, содержащие тонкую, однородную лед. Выберите подходящий отверстие и поместить его в центре поля. Переключение в режим фокусировки и фокусировки изображения. Тогда дефокусировки изображения между 0,5 – 4,5 мкм. Переключение в режим экспозиции и записи изображения. Переключение в режим поиска и повторите шаги 5.2.3-5.2.4.Перемещение по квадратам сетки, избегая предварительно подвергая хорошие отверстия должны быть записаны. Закончить точку сетки и перейти на другую хорошей. Отрегулируйте высоту (Z) и продолжить сбор данных.

Representative Results

Тщательное выполнение всех шагов в Протоколе были обозначены на рисунке 1 позволяет визуализировать замороженных гидратированных, не являющихся окрашенных макромолекул. Результаты для четырех представительных образцов с различными структурными характеристиками показано на рисунке. Их микроскопические изображения, полученные с помощью методов НС и cryoEM сравнивают (рисунок 2). (I) NS изображения AAV5 выявить вирусоподобные частицы около 130 диаметром. Сосуществование полных и пустых структур соответствует нарушена (что разрешить въезд пятен) и структурно нетронутыми капсиды, соответственно. CryoEM показывает равномерно пустые структур; Действительно, эти вирусные частицы не содержат генетический материал 28. NS показывает преобладающие вокруг частиц, тогда как cryoEM показывает в основном шестиугольных частиц, что отражает их форму икосаэдра. (II) Изображения спиральных ВТМ-шоу стержней диаметром 180 Å и переменной длины, часто больше, чем 0,1 мкм, с винтовой повторения 23 видимый какв NS и cryoEM. Центральный канал 40 Å заполнено пятна на изображениях NS и пустой в изображениях cryoEM. (III) Родной KLH, didecamer 8 мда, собирает в характерных баррелей 350 диаметром и длиной 400 Å. NS и cryoEM выявить KLH-х прямоугольных вид сбоку и круговые конца на представлениях. Оба метода выявить шесть страт, перпендикулярной к оси симметрии и равномерно распределенных морфологических единиц в пределах каждого яруса. CryoEM показывает пустую внутреннюю структуру. (IV) Рианодин рецепторов, большой тетрамерный внутриклеточный канал 2,26 мда, рассматривается как квадрат 275 х 275 2. Сложные функции поверхности, такие как центральный крест и центральной депрессии манифеста, так как накопление пятен Н. С., и как нижних отделах плотности, cryoEM. В то время как NS показывает аналогичную контрастность во всех четырех испытанных образцов, сравнение панелей cryoEM подвергает нижнюю SNR (контраст) в RYR1 из-за присутствия моющего средства, чтобы растворить этот мембранный белок. Типичными примерами cryoEM артефактов показаны для RYR1: кристаллического льда, загрязнения льда, астигматизма и интернет-структур (рисунок 3). Их причины и профилактика более подробно описаны в разделе обсуждения. SPA и 3D реконструкция замороженных гидратированных RYR1 показывает четырехкратное симметричную структуру, которая отражает homotetrameric организацию белка (рисунок 4а). Цитоплазматический домен образует квадратную призму 275 х 275 х 120 A 3 и содержит несколько воспроизводимые шаровых домены, образующие строительных лесов структуру. Трансмембранный домен формирует меньшую коническую квадратную призму с максимальными размерами 115 х 115 х 60 ± 3. В резолюции 10 Å можно визуализировать альфа-спиралей (рис 4б). 3D отображение разница может выявить позицию важных лигандов, в этом случае разница Map 3D из FKBP12, 12 кДа белка consideкрасный субъединицы RYR1, накладывается на RYR1 (рис 4С) 29. Наконец, конформационные изменения обеспечивают динамическое представление макромолекулы. В этом случае RYR1 ранее стабилизировалась в любом закрытых или открытых условиях показывает, масса перемещение из закрытой в открытую состоянии (рис 4D) 27. Рисунок 1. Блок-схема методики крио электронной микроскопии. Схеме выделены основные этапы протокола. Рисунок 2. Сравнение НС и cryoEM для различных образцов. () AAV5, икосаэдра вирус. (B) ВТМ, винтовая вирус. На врезках винтовой повторяю, 23 Å. (C) Родной KLH. (D) RYR1; репрезентативные точки зрения выделяются (F, четырехкратное вид и S, вид сбоку). Все образцы загружаются в условиях низкой дозе и при том же увеличении в 50000 с при ускоряющем напряжении 200 кВ. Шкала баров, 10 нм. Все образцы нс на углеродном носителе, cryoEM образцы, C, D находятся на тонкой углеродной над quantifoil, и образец cryoEM B находится непосредственно над quantifoil отверстий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3. Галерея изображений, показывающих обычных артефактов cryoEM на образце RYR1 cryoEM. () Кристаллического льда. (B) Ice загрязнение (стрелки). (C) Астигматизм. RyR1s в астигматизма изображение едва видно. Вставка справа показывает питания ОФЭКТром изображения с асимметричными колец Тон. Вставка слева показывает спектр мощности без астигматизма изображение для справки. (D) с веб-подобные структуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 4. CryoEM и 3D-реконструкция Рианодин рецептора. . () Представление Isosurface (B) Док-кристаллической структуры RYR1 х N-концевого 30 показывает хорошее согласие между атомными координатами и конверт cryoEM; Стрелки указывают на два альфа-спиралей, которые выступают из структуры. Arrowhead указывает одно из четырех спиралей, которые окружают поры ионного канала. Пунктирные линии показывают границы мембраны. (C) RYR1 и 3D вотКатион FKBP12 лиганда (оранжевого цвета). (D) конформационные изменения RYR1 в переходе от закрытого (оранжевый) к открытому (черный меш) конформации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

ТЕМ следует SPA способствовало много высокомолекулярные 3D структуры, приближаясь к 2000 записей в EMDB к середине 2014 г. В целом, для данного макромолекулы, 3D структура с низким разрешением сначала определяется на основе данных NS, который может быть с последующим более высокого разрешение cryoEM 3D структура. Высокий контраст молекулярных границ, предусмотренных NS, что облегчает первый реконструкции 3D, в дальнейшем уточнены cryoEM с его способностью к карте внутреннюю структуру макромолекулы в полностью гидратированном состоянии, а также возможность достичь гораздо более высокого разрешения. Еще одно преимущество cryoEM является устранение обезвоживания стресса, которые могли бы привести к краху макромолекулы. Кроме того, существует возможность опустить опору углерода, который исключает воздействие поглощения можно поверхности и показывает конформацию, что макромолекула принимает в растворе. Крио-отрицательное окрашивание, сочетание cryoEM и NS, дает высокий контраст в полностью гидроксирейтинга образца, а также может привести к 3D реконструкции с использованием SPA, однако она была менее часто используется, с менее чем 10 записей EMDB, отчасти потому, что сам краситель может нарушать целостность макромолекулы 31. Два других методов ПЭМ, способствующие 3D реконструкции являются 2D электронов кристаллографии и электронной томографии. 2D электронов кристаллографии требуется плоскую или трубчатую кристалл; дифракция электронов кристалла, используется для 3D реконструкции потенциально может привести к атомным разрешением 32. В электронном томографии керамических или традиционно фиксированных экземпляров, компонент макромолекулы или субклеточном поворачивается внутри ТЕА для последующего томографической реконструкции 33, с тем преимуществом, что особые объекты могут быть восстановлены; Однако в настоящее время этот метод имеет предел разрешения в диапазоне от 40 до 20 Å 34,35. Среди всех этих молекулярных методов ТЕМ, SPA АПЛ и cryoEM данных была наиболее широкоиспользуемый. Протокол показано здесь посвящена получению cryoEM изображения, пригодные для SPA анализа; тем не менее, большинство из протокола также применимо к cryoEM 2D-кристаллов и образцов томографических.

Успешное проведение сессии cryoEM зависит от комбинированного успеха многих важных шагов; важные аспекты, имейте в виду,, объяснение общей cryoEM артефактов и как их избежать описаны в следующих пунктах. В этом разделе также приведены указания по сбору данных для получения высокого качества 3D реконструкции с использованием метода SPA.

Избегайте перехода в кристаллический лёд. Центральным аспектом является то, что образец должен оставаться в стеклообразном состоянии с момента крио-погружаясь в течение ПЭМ наблюдения. Таким образом, после погружения образца в жидком этана все последующие шаги выполняются в жидком азоте (-196 ° C) или жидкий гелий (-269 ° С) температурах. Потепление выше -135 ° C переходит в стекловидное тело воды вв кристаллической воды; то высокомолекулярные перестройки может иметь место и кристаллы воды доминировать изображение (Рисунок 3А); Образец должен быть отброшен. Случайное образец разминка может произойти, если крио-погружение, передача замороженных сетки между контейнерами (даже если, защищенных gridbox) и / или крио вставки держателя в ТЕА слишком медленно, или если обработки пинцет были недостаточно пред- охлаждается. Значительное вакуум ухудшение ТЕА при крио-передачи (холодные ловушки образец теплее входящий воздух), также могут разогреть образца. Наконец, по-облучения образца также может привести к переходу в кристаллический лёд.

Свести к минимуму загрязнение льда. Учитывая небольшой объем образца (3-5 мкл) наносится на ПЭМ сетки, испарение мог сосредоточиться буферные компоненты (соль, моющие средства) и таким образом влиять макромолекулярную целостности, включая упущенную мультимерного государства. Высокая относительная влажность (RH) микросреда или камера обойтис этой проблемой. Кроме того крио-погружение может быть сделано в достаточно проветриваемом окружающей холодном помещении. После крио-RH погружения должна быть как можно более низкой, чтобы предотвратить загрязнение льда или конденсацию влажности окружающей среды на крио-сетки, как крио-сеткой сам выступает в качестве охлаждаемой ловушки. Загрязнение Ice состоит из частиц с высокой контрастностью и не подструктуры с размерами в диапазоне между ~ 5 нм до нескольких микрон, которые мешают или даже полностью блокировать изображения. Избегайте сквозняки, говорить / дыхания к крио-сетки при передаче воздуха и уменьшить влажность воздуха. Открытые контейнеры с жидким азотом с конденсированной воды (видны как белые взвешенных частиц), также должны быть отброшены.

Увеличьте высокомолекулярные ориентаций / Просмотров. Для поддержки образца, выбор должен быть произведен между истинными дырявых сетей и тонких углеродных над дырявых сетей. Это зависит от (I), как образец распространяется по углеродной пленки по сравнению с углеродными отверстий, (II) можно Образец Concentration, как голые отверстия могут требуют концентрации 100X выше, чем углеродного носителя для одинаковой плотности частиц на изображении (от ~ 0,02 до 2 мкм) и (III), как случайная является распределение макромолекул ориентации. Обратите внимание, что тлеющий разряд, который делает углерода гидрофильные, будет иметь важное влияние во всех трех аспектах, и что это будет образец зависимыми. Что касается ориентации макромолекулы, в то время как рецидивирующий вид желательно для начальной Структурное определение случайной конической реконструкции, случайность высокомолекулярных видом желательно, когда уточнение 3D-реконструкция в высоких разрешениях. В нашем примере, RYR1 взаимодействует с углеродом с любимым "в четыре раза" взгляда (рис 2D) и требует дырявые сетки на случайность ориентации и высоким разрешением 36.

Увеличьте SNR. Лучшая стратегия для увеличения SNR является снижение фона источников шума. Чрезмерное льдатолщина и (если имеется) углерода толщина пленки сверх того, что необходимо поддерживать и внедрять белок добавить дополнительный шум. Таким образом, толщина льда должна быть снижена до минимально необходимой, контролируя промокательной время, давление, влажность и качество фильтровальной бумаги. Для поддержки углерода, тонкий (~ 5 нм) углеродной пленки наслаивается на толстой дырявой углерода фильме: толстый перфорированный углерода обеспечивает механическую прочность, а образец изображается на тонкой углеродной покрытые отверстие. С другой стороны, обратите внимание, что чрезвычайно тонкий лед и / или углерода может привести к легко нарушена поддержки, которые могут превратиться в сети (фиг 3D). Чтобы максимизировать ОСШ, либо ненужные компоненты буфера следует избегать. Для мембранных белков, моющее средство занимает значительное сказывается на контрастности (рис 2D, правая панель). Кроме того за счет снижения поверхностного натяжения моющее средство изменяет способ, в котором образец распространяется на поддержку. Некоторые мембранные белки требует присутствия липидов в дополнение к опрergent, что еще больше снижает контрастность. Чтобы преодолеть эту пробу можно разбавить в буфере с низкой концентрацией моющего средства и без липида непосредственно перед погружением крио-37. Новые альтернативные моющие средства 16 и использование nanodisks 38 для стабилизации компонент трансмембранный домен, как представляется, успешные подходы к визуализации мембранных белков cryoEM.

Стремитесь к высоким качеством изображения и подготовиться к коррекции CTF. Витрифицированные образцы требуют высоких значений дефокусировки для создания достаточного изображение (фаза) контраст в CTF, функция, которая относится интенсивность частоте, имеет несколько нулевых переходов, на которой не указывать нет Информация. В то время как коррекция CTF не является необходимым для 3D реконструкции с низким разрешением, когда мы стремимся к более высоким разрешением, чтобы восстановить точное представление о 3D-объекта, изображения с разных defoci должны быть собраны таким образом, чтобы вычислительная CTF коррекция может быть сделано.CTF определение и исправление включено в крупных SPA программных пакетов 4-7; Детали можно найти в других 39. Для оптимальной коррекции CTF, использовать диапазон defoci. Хорошая стратегия для переключения между 3-4 значений дефокусировки. Значения зависят от размера макромолекулы (большие размеры требуют меньше расфокусировки), толщина льда / углерод (тоньше образец требует меньше расфокусировки), а напряжение (напряжение ниже, требует меньше расфокусировки). Для 200 кВ, хорошая отправная диапазон значений 2,5, 3, 3,5 и 4 мкм расфокусировки. CTF проявляется в виде чередующихся колец высокого и низкой интенсивности (Thon кольца 40) в обратном пространстве представления, спектра мощности. Отображение спектра мощности будет раскрыть потенциал для разрешения; частота широкой видимой Thon кольца ближе априорная оценка достижимый размер. Спектр мощности должны периодически проверяться, и астигматизм (не круговой) кольца Thon (рис 3C) должны быть исправлены с объективной стигматором. Кольца Thon должны быть видны по крайней мере, вплоть до разрешения желаемого.

CryoEM набор данных, полученный с помощью этого протокола может быть непосредственно обработаны SPA для того, чтобы генерировать 3D-реконструкция. Даже при идеальном образце, качество реконструкции 3D будет зависеть от характеристик и характеристик ТЕА оборудования, а также на обработке изображений. В условиях продолжающегося улучшения в обоих этих фронтах, и с особым упоминанием к недавно разработанных прямых электронных детекторов, возможность получения 3D реконструкции с атомным разрешением более последовательно ближе, чем когда бы то ни было.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Ethane Airgas 371745 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable
Liquid nitrogen Airgas 27135 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers Ted Pella 5326
Mica sheets, 1 x 4 cm Ted Pella 54
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type Electron Microscopy Sciences 70220-45
350 ml cryo-dewars Pope 8600
Cu 400 mesh holey grids  Quantifoil Quantifoil Q10525
Cu 400 mesh holey grids C-Flat Protochips CF-1.2/1.3-4C
Glow discharge device Electron Microscopy Sciences Model E7620
Turbo pumping station Gatan Model 655
Carbon evaporator Denton Vaccum Model 502B
Freeze plunger FEI Vitrobot Mark IV
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Image Processing software EMAN http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Image Processing software Spider http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Image Processing software Freealign  http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
3D visualization software Chimera http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin Biosyn
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
  2. Franzini-Armstrong, C. RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units. Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).
  3. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
  4. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  5. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Ludtke, S. J. 3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN. Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).
  8. Radermacher, M., et al. Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle. J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).
  9. Stewart, A., Grigorieff, N. Noise bias in the refinement of structures derived from single particles. Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).
  10. Serysheva, I. I., et al. Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel. Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).
  11. Cheng, Y., et al. Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques. J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).
  12. Stark, H. GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).
  13. Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).
  14. Amunts, A., et al. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
  15. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, e00461 (2013).
  18. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).
  19. Lerch, T. F., et al. Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution. Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).
  20. Govindasamy, L., et al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).
  21. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).
  22. Ge, P., Zhou, Z. H. Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).
  23. Clare, D. K., et al. ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin. Cell. 149 (1), 113-123 (2012).
  24. Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. Molecular model of the human 26S proteasome. Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).
  25. Gatsogiannis, C., Markl, J. Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units. J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).
  26. Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. Membrane proteins: the ‘Wild West’ of structural biology. Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).
  27. Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. . Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).
  28. DiMattia, M., et al. purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).
  29. Samso, M., Shen, X., Allen, P. D. Structural characterization of the RyR1-FKBP12 interaction. J Mol Biol. 356 (4), 917-927 (2006).
  30. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  31. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  32. Kuhlbrandt, W. Introduction to electron crystallography. Methods Mol Biol. 955, 1-16 (2013).
  33. Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches. Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).
  34. Briggs, J. A. Structural biology in situ–the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  35. Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography. Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).
  36. Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM. Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).
  37. Sharma, M. R., et al. Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor. J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).
  38. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  39. Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome. J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).
  40. Thon, F. . Phase contrast electron microscopy. , (1971).

Tags

Cryo-electron MicroscopyCryoEMSample PreparationMacromolecular 3D ReconstructionTransmission Electron MicroscopyTEMSingle-particle Image Processing3D Structural DeterminationPurificationVitrificationImage Processing SoftwareStructural DeterminationMacromolecular MachinesPseudo-atomic StructuresAtomic Resolution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cabra, V., Samsó, M. Do’s and Don’ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (95), e52311, doi:10.3791/52311 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image