신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성
Summary
This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP).
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed.
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates.
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
Introduction
신경계 장애의 치료에 유용한 요법을 구현하는 더 큰 문제는 변성을 방지하고 또한 기능의 회복을 촉진 효과적인 방법을 개발하는 것이다. 혁신적인 전략은 이식 전에 그들의 신경 보호 인자의 생산을위한 유전자 엔지니어 줄기 세포 체외이다. 유전자 치료의 형태로 결합 된 세포 기반 치료의 조합은, 신경계 질환 또는 손상 유발 신경 사망의 치료를위한 강력한 방법을 제공한다.
신경 영양 요소는 성숙한 신경 세포의 성장과 개발 뉴런의 생존뿐만 아니라 유지 보수 및 소성에 필수적이다. 다수의 연구는 중추 및 말초 신경계에서 신경 (CNS 및 PNS)의 초기 성장과 분화를 촉진하는 신경 영양 인자의 중요한 역할을 입증하고 또한 관내 및에서 재생을 자극 할 수있다신경 손상 1 nimal 모델. 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF)는 매우 CNS 표현과 신경 개발, 시냅스 가소성 및 수리 (2)를 조절하는 중요한 역할을 담당한다. 폐해 세포주 유래 신경 영양 인자 (GDNF)는 도파민과 motorneurons 3를 포함하여 신경 세포의 많은 유형의 생존을 촉진한다. 따라서, 신경 수리 중요한 전략은 신경계의 부상이나 질병 영역에 신경성 외인성 소스를 제공하는 것이다.
능성 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)가 손상되거나 병에 걸린 신경을 치료하는 치료 용 단백질의 전달을 위해 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그들은, 2) 다 분화능 용량, 3) 거의 윤리적 문제, (4) 분리 및 유지 1) 비교적 용이 포함한 다수의 이점을 갖기 때문에 엽 줄기 세포의 이식 환자 호환 세포 – 기반 치료법을 개발하기위한 노력으로 상당한 주목을 받고) 생존 및자가 이식 4,5에 대한 이식 및 5) 가능성을 다음 마이그레이션 할 수있는 능력을. 유망한 결과는 척수 손상 6,7, 8,9 뇌졸중, 미엘린 결핍 10, 망막 변성증을 포함한 다양한 신경 퇴행성 11-13 조건의 수에 대한 동물 모델에서의 나이브 및 유 전적으로 조작 된 중간 엽 줄기 세포의 사용과보고되었다. 유전자 조작 된 줄기 세포에서 신경 영양성 인자의 전달과 세포 이식을 연결하는 것은 신규하고 중요한 신경 복구 전략이다.
세포 기반 치료 인자 전달 시스템의 개발에 필수적인 단계는 설계 세포의 정상 상태를 결정하는 것이다. 따라서, 본 연구의 주 목적은 유전 공학 성체 줄기 세포의 일반적인 성장 파라미터를 평가하는 것이었다. 빠르게 여러 세포 매개 변수를 평가하는 중요한 방법은 셀룰러 이미지 기반 높은 스루 screenin을 사용하는 것이다g (HTS)을, 종종 높은 콘텐츠 스크리닝 (HCS) 절차 (14)라고합니다. 이 기술은 자동화 된 이미지 획득 및 분석이 가능하고,이 방법은 줄기 세포 연구 어플리케이션에 특히 적합하다. 이 프로젝트에서 우리는 유전자 조작 성체 줄기 세포는 HCS 시스템을 채용와 세포 기질 환경 설정 및 세포 기능의 빠른 특성 및 최적화를 가능하게하는 프로파일 플랫폼을 개발했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성인 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)은 셀룰러 및 유전자 전달 기반 치료법을 조합 한 실험 전략의 개발을위한 매력 세포 유형이다. 중간 엽 줄기 세포는 17, 18 패러다임 / 차별화 적절한 유도와 신경 및 신경 교세포 계통에 transdifferentiating, 중배엽 계통의 세포로 분화 할 수있는 다 능성, 그리고 상당한 소성을 표시합니다. 또한, 중간 엽 줄기 세포 이식 및 신경 퇴행성 조건 (19)을 포함하여 장애의 숫자에 대한 임상 연구에서 효과가 입증되었다. 중간 엽 줄기 세포의 치료 효과는 부대 유익한 항 증식, 항 염증 및 항 아폽토시스 활동 (20)에 의한 공지되어있다. 중간 엽 줄기 세포는 가능성이 부상 또는 질병 (21)의 사이트에 이식 다음 순진한 중간 엽 줄기 세포와 관련된 신경 품질에 기여하는 다양한 신경 영양과 성장 인자를 생산하고 분비하는 것으로 알려져있다. IMPOrtantly, 중간 엽 줄기 세포는 유전자 결합 셀룰러 및 유전자 요법 기반 애플리케이션을위한 신경 영양 인자의 지속적인 전달을 위해 수정 될 수 있으며, CNS 11,19,22 상해 또는 질병의 동물 모델들에서 이용되어왔다.
결합 된 세포 및 유전자 치료 기반 전략을 개발에서는, 셀의 상태가 심하게 체외 그들의 광범위한 사용에 앞서, 특히 생체 내 용도로 평가하는 것이 중요하다. 개념의 증거로서, 우리는 높은 콘텐츠 심사 (HCS) 방식을 사용하여 세포의 건강과 체력에 유전자 조작의 결과를 연구하기 위해 설계 및 제어 MSC 라인의 다수의 인구를 조사 하였다. 일반적으로, HCS 세포 이미지 기반의 높은 처리량 검사 (14)를 의미한다. 이 검사 방법은 공간의 여러 수준 (일 밀리 초) (세포 내에 셀) 및 시간 해상도에서 세포 표현형의 정량적 평가를 허용다양한 실험 조건에서 해결 방법. 세포 증식, 녹색 형광 단백질의 발현 (GFP), 세포 사멸, 세포 운동성 / 마이그레이션 : 우리는 다음과 같은 매개 변수에 대한 기판 환경에서 가능한 차이를 액세스이 방법을 사용. 실험은 96 웰 세포 배양 플레이트 형식으로 설계 하였다. 하나의 판 안에 우리는 일상적으로 렌티 바이러스 형질 세포의 다른 MSC 인구에 대한 각 매개 변수에 대한 가능한 기판 관련 차이를 조사하고 원본과 설계 중간 엽 줄기 세포, 비 형질 중간 엽 줄기 세포를 비교했다. 이것은 직접 저속 디지털 이미징을 수행하여 프로피 듐 요오다 이드 염색을 이용 Ki67에 immunolabeling 라이브 / 죽은 세포 생존력 분석을 이용하여 이러한 세포 증식과 같은 시험 관내 어 세이의 배터리 셀 동작과 다른 MSC 아형에 대한 결과를 비교하는 수단을 구비 . 하나는 개별 w에서 수집 된 배지 샘플에 ELISA를 수행 할 수 있습니다이 HCS의 확장으로ELL을 정량적으로 신경 영양 인자의 분비를 결정합니다. 다른 MSC 아형 조정 배지에서 분비 된 인자도 11,23의 생물학적 활성을 측정하기 위해 시험 관내 생물학적 정량에 사용될 수있다. HCS 플랫폼이 유형의 일차 배양 신경과 신경 줄기 세포주 (24)로부터의 신경 돌기의 시험 관내 측정을 위해 사용될 수있다. 전반적으로, 우리의 결과는 유 전적으로 변형 된 중간 엽 줄기 세포의 하위 집단은 비 개질 된 중간 엽 줄기 세포에 비하여 유사한 동작을 표시하는 것이 보였다. 세포 성장 및 세포 이동에 대한 다양한 배양 기판의 영향은 극적 MSC 서브 타입간에 차이뿐만 아니라, 배양 기재하지 않았다. 이와 같이, 테스트 외 매트릭스 기판이 상이한 엔지니어링 된 중간 엽 줄기 세포에 대한 이들의 행동 양상을 조절하는 중요한 역할을하는 것으로 나타나지 않았다.
이 연구는 differen 분석 HCS 시스템의 사용을 보여세포 행동의 양상 t. 그러나, 이미지 분석과 관련된 한계가 발생하는 것은 드문 일이 아니다. 형광 이미지를 분석하면서 경우에 따라, 그것은 immunolabeled 또는 염색 된 세포가 아니라 적극적으로 염색 / 표지 카운트 될 것이다 위에 올바른 임계 값을 결정하기 위해 다소 어려웠다. 따라서, 주관적 바이어스를 최소화하기 위해, 임계 값의 결정은 제어와 비교 (형광 이미징에 대한 음성 대조군은 일차 또는 이차 항체의 생략에 의해 모든 처리 중에 병렬로 수행 하였다)에 의존했다. 또 다른 제한은 저속도 디지털 이미징을 사용하여 세포 이동의 분석 중에 발생했습니다. 어떤 경우에는, 이미지 소프트웨어 실제로 오직 매우 짧은 거리를 이주 세포 대 세포의 임의의 브라운 운동 사이를 구별 할 수 없었다. 분석 소프트웨어는 multip의 존재를 구별 할 수 없었다 여기서 추가적인 제한 상황에서 분명했다한 다른 매우 근접 르 셀. 분석보다는 완전 자동 분석시 이러한 제한 필요한 수동 셀 선택을 극복. 셀 도금 밀도는 서로 분리되어 성장하는 세포에 비해 대단히 짧은 시간에 성장하는 큰 선호를 표시하는 세포의 집단 사이에 세포의 이동 데이터를 기울이 발생할 수 있습니다. 이러한 타입의 차이는 일부 가능성 세포 – 세포 대 세포 – 기본 기판의 반사에있다.
이미지를 수집 및 데이터 분석을 수행 할 HCS 시스템을 사용하면 효율적이고 신속한 수단은 복수의 셀 파라미터를 평가하기 위해 제공한다. 또한, 30 가지 조건 (6 기판과 5 가지 MSC 하위 유형)에 대한 시간 경과 디지털 비디오 정기적으로 환경 챔버를 사용하는 동안 시간에서 일 (48 시간)에 이르는 기간 동안 획득했다. 이 데이터는이어서 다른 ECM 다양한 세포주에 걸쳐 세포의 이동 속도의 차이를 계산하고 결정하는 데 사용되었다분자.
이 보고서에서 우리는 세포의 건강과 기능을 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 플랫폼의 구현을 강조했다. 이러한 유형의 분석 직접 세포 성장 및 신경 재생을 촉진하는 세포 유형뿐만 아니라, 폴리머 기판을 설계하기위한 합리적인 전략을 개발하는데 유용하다. 이는 세포 이식 전략을 사용하여 생체 내에서의 전임상 연구 전에 광범위한 치료 학적 요인 줄기 세포 기반 배출인가 향해 필수적인 단계이다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).
Materials
| 96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
| Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
| DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
| Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
| ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
| Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
| Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
| K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
| L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
| Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
| Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
| Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1M PO4 buffer |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
| Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
| Trypsin 0.05% (EDTA 1X) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
| Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
| MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |
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