隔离成人肠道干细胞<em>果蝇</em>肠用流式细胞仪研究干细胞的行为在老化

从FAC 50,000-100,000细胞分选，160和200肠之间获得需要进行解剖。显然，这是最耗时的整个过程中的步骤。在图1A所示的卡通图示肠道夹层，其中详细这里提供的协议描述的主要步骤。此过程可以单独修改。甲解剖，整个消化道示于图1B。 当所有的肠组织已被消化，立即继续FAC排序。继在协议中所述的门策略使得细胞群富集ISC的和胚从年轻的（ 图2）的成功识别和分类 ​​，并从旧肠（ 图3）。则P1栅极被设置为只包括健康的活细胞，以及栅极出死细胞。细胞绘制超过10 3的对数Y型斧在使用太平洋蓝色通道被定义为死细胞。该下面40上的X轴（FSC-A）的曲线图大多碎片，因此该点也被排除在外（ 图2A）。在SSC-A的散点图与FSC-A的电池是基于它们的大小和粒度分布。为获得最佳的分辨率，将细胞放置在散点图如通过调整光电倍增管（PMT）的电压示于图2B。在散点图FSC-H与FSC-W和SSC-H与SSC-W单细胞从基于尺寸（ 图2C）聚集体和双峰分离并基于粒度（ 图2D）。当描绘包括在栅极P4在直方图，GFP阴性，GFP 低 （栅极P5）的独特分离和GFP 高 （栅极P6）细胞中的细胞是可见的（ 图2E）。细胞表现出较低的GFP强度是小的和较少的颗粒，并代表ISC的。细胞表现出较高的GFP INT密度更大，更精细的和表示的EB。上的cDNA由RNA合成各GFP阳性种群细胞逆转录酶（RT）-PCR用于DL（门P5，P6）表明所述DL信号是在较小的， 低的GFP细胞比在较大的，GFP 高确实更强细胞（ 图2H）。然后将细胞backgated并在等高线图中描绘，以确认该GFP 低 （栅极P5）和GFP 高 （栅极P6）细胞不同尺寸和粒度（ 图2F）和仍然活着（ 图2G）。值得注意的是，GFP阳性细胞的两个峰（GFP 低和GFP 高 ）只能是很好分辨如果FITC（绿色荧光蛋白）的信道已经校准使用在协议中描述的控制正常。 整理旧胆量（ 图3）衍生ISC的当同一门控策略使用。散点图（ 造型玩具ê3A-D）中，直方图（ 图3E）和等高线图（ 图3F，G）的 ​​类似于图2中所示的那些。如以上所提到的，不存在真正的标记物，以确定ISC的旧肠，因此没有RT-PCR数据在这里呈现。然而，耐人寻味的观察这里是含GFP 低 （门P5）或GFP 高 （门P6）细胞的两峰老化过程中保持明显分开。此外，细胞在GFP 高 （栅极P6）峰的数目老化，这清楚地模拟misdifferentiated的EB随着年龄的已知累积期间显著增加。在这两个细胞群体的比率的变化，也可以在散点图看出（对比图3A-D和图2A-D）和在所述等高线图（比较图3F，G与图2F，G）。从这些发现，我们的结论是通过对GFP的排序使用FACS阳性细胞，我们可以在年轻人和老年人肠富集ISC的和EBS。 为了验证隔离ISC的和EBS的纯度，后排序分析进行（ 图4）。该直方图后整理ISC的和EBS（ 图4B，C）中描绘的95％和98％之间的纯度。 如果设置如上所述的FACS参数的层次是严格遵循，这两种不同的细胞群（GFP 低 ，体积小和GFP 高 ，大）已经可以在散点图的GFP与FSC-A（ 图5A）不同。这两个细胞群体无法区分，如果这个层级被忽略（ 图5B-D）。 图1：（A）的狄氏的主要步骤示意图电视机飞肠。首先，头部被移除（除去翼是可选的），接着在胸部和腹部，以暴露肠道的分离。肠道随后从体腔中解脱出来，在下面的步骤。黑箭头显示解剖的进展，而暗红色箭头表示拉伸方向。在最后一个图像的红线表示中肠的前部和后部的边界。（B）的成年果蝇肠道的光学显微镜图像。主要区域和解剖特征被标记。红线标记肠的边界。 图2：被FAC排序策略，识别和年轻的（7天）肠隔离ISC的和EBS为了更好的可视化，细胞较ISC的以红色突出显示，并代表胚细胞突出在散点图（AD）的蓝色和在等高线图（F，G）。（A）中的 P 1的栅极被设置为排除以上10 3绘制在对数Y轴上死，SYTOX阳性细胞。在FSC-A的阈值设置在40至还排除死细胞和碎片。（B）细胞的门FSC-A和SSC-A根据大小和粒度（门P2）选择单元格。该直方图（E）用于并联识别GFP阳性细胞的FSC-A对SSC-A散点图（B），（C，D）的散点图FSC-H与FSC-W和SSC-H与SSC-W用来除去团粒，双峰，并选择单峰（在C栅极P3和P4的栅极在D中）。（e）该直方图示出了细胞和它们的GFP强度的数目。两个峰值，绿色荧光蛋白低 （栅极P5）和GFP 高 （栅极P6）能够被区分。（F，G）将细胞回门控中的等高线图，以验证该两个不同的GFP阳性细胞populat离子是正确的尺寸（F）的和含有活细胞（G）。（H）的逆转录酶（RT）-PCR用于DL上的cDNA从存在于第一峰（栅极P5）的细胞中分离的RNA合成的，并在第二峰（栅极P6）分别。可在细胞出现在门与P5 P6门被检测更多去离子表达。微管蛋白担任装载控制。 请点击此处查看该图的放大版本。 图3：FAC排序策略，以识别和旧的（60天）肠隔离ISC的和EBS为了更好的可视化，是代表ISC的细胞以红色突出显示，并代表胚细胞蓝色的散点图（AD）突出和。等高线图（F，G）。（A）中的 P 1的栅极被设置为排除以上10 3绘制在对数Y轴上死，SYTOX阳性细胞。在FSC-A的阈值设置在40至还排除死细胞和碎片。值得注意的是，在较大的GFP阳性细胞的年龄依赖性增加已经是明显的在此情节。（B）的细胞门控为FSC-A和SSC-A根据尺寸和粒度（栅极P2）来选择细胞。该直方图（E）用于并联识别GFP阳性细胞的FSC-A对SSC-A散点图（B），（C，D）的散点图FSC-H与FSC-W和SSC-H与SSC-W用来除去团粒，双峰，并选择单峰（在C栅极P3和P4的栅极在D中）。（e）该直方图示出了细胞和它们的GFP强度的数目。两个峰值，绿色荧光蛋白低 （栅极P5）和GFP 高 （栅极P6）能够被区分。值得注意的是，含有较大的细胞的细胞群GFP 高增加了我在老龄化n个。（F，G）细胞，背门在等高线图来验证两个不同的GFP阳性的细胞群体是正确的大小（F）和含有活细胞（G）。 请点击此处查看该图的放大版本。 图4：A类后分析，以确定孤立ISC的和EBS的纯度（A）GFP阳性细胞从年轻（7天），老（60天）肠是FAC整理和直方图显示它们的分布到基于GFP强度两个峰值。（B）该职位排序分析表明孤立ISC的从年轻人和老年人肠是> 97％的纯度。（C）排序电子商务的后期排序分析学士学位，年轻人和老年人肠显示> 95％的纯度。细微的杂质可能是由于荧光猝灭或因重新排序的细胞机械损伤GFP表达细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。 图5：该显示不理想的FACS数据，当未设置所述的FACS参数适当地被视为散点图实施例（A）的代表性FACS所有小区的信息时的FACS参数分别设定适当的基础上在该协议中描述的对照。含ISC的细胞群体是红色圆圈和含胚细胞群体是盘旋在蓝色。盘旋在绿色的细胞是死细胞具有更强的自体荧光相比，活细胞，其被绘制低于10 3上的对数y轴。（B）散点图显示了当的FACS仪器未校准获得的典型结果。没有检测到GFP阳性细胞。（℃）如果FSC设置不正确，未检测到不同的GFP阳性细胞群。（D）中如果FITC（绿色荧光蛋白）信道不正确调整，大部分GFP-的进行排序阳性细胞散点图，而是沿着剧情的上边缘不会绘制。另外，在此处示出的曲线图，该限制为自发荧光不调节，因此，细胞积高于10 2上的对数y轴实际上是自体荧光和可能被误认为是GFP阳性细胞。