La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

La jonction neuromusculaire (JNM) est la synapse de relais essentiel qui médie la communication entre le système nerveux et le muscle squelettique. Il est nécessaire pour tout mouvement volontaire. La microscopie à fluorescence a longtemps été utilisé pour étudier les effets des transgènes sur la souris NMJ ^1-3 ou de comparer les effets de l'âge, l'alimentation, l'exercice et la maladie sur NMJs de rongeurs ^4-11. Ces études nous ont beaucoup appris sur la physiologie et la physiopathologie de la NMJ, mais les divers paramètres déclarés (par exemple, la zone AChR, zone flasque, longueur du périmètre, indices de fragmentation) font qu'il est souvent difficile de comparer les résultats de ces études. Il ya une attente de plus en plus pour les chercheurs précliniques pour pouvoir démontrer la reproductibilité, en particulier dans les études avec des modèles de rongeurs de la maladie ^12. Les protocoles décrits ici ont été affinées par une série d'études qui a enquêté ch développement, physiologique et physiopathologiqueAnges à l'NMJ. Ces études nécessitent la mesure de la zone de spécialisations synaptiques à la plaque motrice de la souris et de la densité relative de l'emballage de protéines synaptiques dans les spécialisations post-synaptiques ^13-15.

L'utilité de ces méthodes est illustrée par des études récentes dans un modèle de souris de l'anti-MuSK myasthénie. Injections quotidiennes d'IgG de myasthénie anti-MuSK positif gravis patients dans des souris adultes causés à devenir faible dans les deux semaines ^16. Confocale images maximale de projection de sections musculaires qui ont été doublement marquée pour la synaptophysine (en nerveuses terminaux) et post-synaptiques AChR révélé un déclin progressif dans le domaine de AChR coloration que le principal changement. Surtout le taux de déclin était suffisante pour expliquer les baisses comparables dans l'amplitude des potentiels synaptiques, l'échec de la transmission synaptique et une faiblesse musculaire ^17,18. Qualitativement résultats similaires ont été rapportés par d'autres groupes de recherche^10,19. Les mêmes méthodes de mesure NMJ ont depuis été utilisés pour évaluer l'impact de trois médicaments pour le traitement anti-MuSK myasthénie grave dans ce modèle de souris ^20,21.

Vieillissement sédentaire peut conduire à la perte de connexions neuromusculaires. Les protocoles décrits ici ont révélé une baisse liée à l'âge dans le domaine de terminaison nerveuse synaptophysine à plaques motrices que les souris progressent dans la vieillesse. Les mêmes méthodes ont révélé que l'exercice volontaire pourrait largement éviter la réduction de nerf présynaptique zone de la borne ^22, en accord avec les travaux antérieurs par d'autres groupes ^4. Perte de connexions neuromusculaires se produit également dans le modèle de la souris SOD1G93A de la sclérose latérale amyotrophique ^9,23.

Les études mentionnées ci-dessus démontrent que une variété de conditions de santé peut conduire à des réductions dans le domaine de spécialisation soit pré- ou post-synaptiques au NMJ. Cela peut entraîner dans l'amusement synaptique altéréection ou peut annoncer une perte complète de la connexion neuromusculaire. Trois protocoles sont décrits qui permettent la quantification de la superficie et de la densité de spécialisations synaptiques. Le but du premier protocole est de fournir une mesure pratique et reproductible des zones de pré et post-synaptiques spécialisations et leur alignement au NMJs mammifères, en utilisant la microscopie de fluorescence. Images bidimensionnelles projection confocale maximales et analyse d'image avec les NIH ImageJ est utilisé pour détecter des changements dans le domaine de la coloration (synaptophysine des vésicules synaptiques), AChR post-synaptiques et de la zone de chevauchement synaptique. Paramètres d'imagerie confocale (gain et décalage de niveau) sont optimisés pour chaque NMJ de façon à maximiser l'information visuelle utilisée pour discerner le domaine de spécialisation synaptique. Insuffisance neuromusculaire peut également résulter de changements dans la densité post-synaptique du CCRS et / ou d'autres protéines synaptiques. Le deuxième protocole peut être appliqué à détecter les changements dans la densité relative de ces protéines postsynaptiquesque le musc, rapsyne, dystroglycane, phosphorylée kinase Src et phosphorylée AChR ^18,21.

Dans la myasthénie grave, une densité réduite de AChR dans la membrane post-synaptique est la cause immédiate de l'insuffisance synaptique et une faiblesse musculaire. Le troisième protocole décrit une méthode Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour évaluer les changements dans la proximité de AChR adjacentes dans des membranes post-synaptiques ^14,15. Cette méthode détecte transfert d'énergie entre AChR voisins marqués par fluorescence-α-bungarotoxine (BGT). FRET se produit uniquement lorsque les sondes fluorescentes donneur et accepteur sont à moins de 10 nm de l'autre. Cela peut révéler (microscopiques) des changements dans l'étanchéité de AChR emballage qui peuvent être directement liés à l'amplitude des potentiels synaptiques.

Ces trois protocoles, raffinés au cours de la dernière décennie, fournissent des mesures complémentaires d'intégrité NMJ d'une manière cohérente et reproductible. Utilisation de protocoles normalisés unend paramètres devraient faciliter la comparaison des effets des gènes et des interventions environnementales sur le NMJ mammifères.