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신경과학

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

Published: November 14, 2014
doi:
10.3791/52204
, , , ,
1Department of Neurology,University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I,University of Münster

Summary

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Abstract

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.

Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.

This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Introduction

Microvascular del cerebro las células endoteliales (CEMB) monocapas de forma que son una parte integral de la barrera sangre-cerebro-barrera altamente especializado (BBB). BMECs están interconectados por las proteínas de unión unidos a una membrana basal. Junto con los pericitos, células del músculo liso, pies finales astrocytic y las células sanguíneas circulantes se acumulan la llamada unidad neurovascular (NVU) 1. Contra la noción anterior de una barrera impermeable entre la sangre y el sistema nervioso central (CNS), el NVU es una interfaz dinámica y altamente específico y regulado que controla la transición de fluidos, moléculas y células entre los vasos sanguíneos cerebrales y del sistema nervioso central 2 . Una disfunción o desregulación de la NVU pueden iniciar y / o contribuir a una variedad de neurovasculares, enfermedades infecciosas, inflamatorias o degenerativas del SNC, tales como accidente cerebrovascular isquémico, el VIH-encefalopatía, la esclerosis múltiple, de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson 3-6.

_content "> La monocapa BMEC está cerrado herméticamente por un complejo de unión constituido de apretado (TJ) y uniones adherentes (AJ) 7. La alta resistencia eléctrica y la baja permeabilidad paracelular de la acreditación se basan principalmente en las proteínas TJ 8. Los TJs son complejos formados por las proteínas transmembrana de la familia claudin y ocludina, que están vinculados al citoesqueleto de las células endoteliales de moléculas adaptadoras, como los zonulaoccludens (ZO) proteínas ZO1-3 4. las uniones adherentes se ensamblan principalmente por la proteína integral de la membrana endotelial (VE) -cadherin vascular, que está vinculado al citoesqueleto a través de cateninas 8.

El cierre hermético de la acreditación impide el libre intercambio de sustratos y células entre la sangre y el líquido cefalorraquídeo. Las excepciones a esta regla son lipofílicas, pequeñas moléculas con un peso molecular <400 Da, que son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica por mediada por lípidos difusión 9. El paso del más grande y / omoléculas hidrófilas, tales como glucosa, aminoácidos, péptidos, proteínas y muchos fármacos se limita a sistemas altamente controlados transcelular de transporte 10, que pueden clasificarse en cinco categorías principales: transporte mediado por portador, el transporte de iones, el transporte de expulsión activa, mediada por los receptores transporte, y caveolae mediada por el transporte 4. Estos sistemas de transporte ayudan a mantener la homeostasis del SNC, que se requiere para una generación de señal precisa, la transducción y la integración. Por otra parte, BMECs son capaces de controlar activamente la transición de moléculas diferentes por la expresión de una variedad de ectoenzimas. Estas enzimas se localizan en la superficie celular y modificar sustratos endógenos y exógenos específicos impidiendo o permitiendo la transición de la acreditación 11.

Considerando que el SNC era considerado como un órgano inmunológicamente privilegiado para un largo tiempo, los recientes hallazgos sugieren un sistema más dinámico y bien regulado de una vigilancia inmuneha ejercido una vigilancia de la CNS. Los BMECs están críticamente involucradas en la regulación de la transmigración de las células inmunitarias. Por la expresión de selectinas en sus linfocitos de superficie son inducidas selectivamente para acoplar con flojedad al endotelio. La secreción de quimiocinas que se enfrentan con receptores específicos en los leucocitos conduce a la expresión o los cambios conformacionales de las integrinas de leucocitos, tales como LFA-1 (antígeno asociado a la función linfocitaria-1) y VLA-4 (antígeno muy tardío-4). Las integrinas median una adhesión firme mediante la unión de sus contrarreceptores endoteliales, por ejemplo VCAM-I (molécula de adhesión celular vascular), ICAM-I (molécula de adhesión intercelular) que permiten la transmigración en el parénquima cerebral o entre a través de la BBB BMECs 12-14. Estos y otros hallazgos subrayan el papel activo del propio endotelio en la regulación de la migración de células inmunes.

Por otra parte, BMECs como parte del NVU están involucrados en la regulación de la li flujo sanguíneo cerebralnked a las demandas metabólicas neuronales locales. Tras la estimulación de los astrocitos células endoteliales producen sustancias vasoactivas como el óxido nítrico que conduce a la relajación de las células musculares lisas vasculares 15.

La angiogénesis y la neurogénesis en el desarrollo, así como en el adulto cerebro muestran patrones y el desarrollo paralelo y compartir muchas de las propiedades de la regla 1, 4. Las células endoteliales están implicadas críticamente en estos procesos 16, 17.

En resumen, BMECs proporcionan características esenciales para garantizar un correcto desarrollo y funcionamiento del SNC. Disfunción acreditación está vinculada a muchos trastornos neurológicos graves. Sin embargo, sólo muy pocos objetivos se han identificado en la interfaz cerebro-vascular para un tratamiento específico y eficaz 18. Simplificado en modelos in vitro se han utilizado para entender los mecanismos que intervienen en la función y regulación de los sistemas fisiológicos complejos de lotiempo ng. El aislamiento descrito por este manuscrito y el estudio in vitro de murino BMECs, dada la gran variedad de ratón específico knockout cepas, podría proporcionar una comprensión adicional de la acreditación función y regulación en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas que se abren nuevas vías terapéuticas.

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por las autoridades locales ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz; Recklinghausen, Alemania") y llevaron a cabo de acuerdo con la ley alemana de protección de los animales. 1. Comentarios generales para experimentos con ratones Lleve a cabo todos los experimentos con ratones de acuerdo con las directrices del Comité de Animales Institucional de Cuidado y Uso respectivo. Mantenga los ratones en condiciones libres de patógenos y que puedan tener acceso a alimentos y agua ad libitum. Utilice ratones por edad y sexo en los grupos experimentales ya que las propiedades biológicas pueden variar con la edad y el género. Siempre que sea posible tratar de reducir, refinar o sustituir los experimentos con animales. 2. Preparación del gradiente de Percoll Mezclar 19 ml de 1x PBS con 1 ml de 10x PBS, 1 ml de FCS y 10 ml de Percoll. Realizar steirritar a la filtración en un tubo de vidrio (diámetro de los poros del filtro: 0,2 micras). Después almacenar la solución a 4 ° C. 3. Preparación de Medio endotelio celular y revestimiento de placas de cultivo celular Medio celular endotelial: Preparación del medio de 500 ml: (aprox. 20%) Mezclar 400 ml de DMEM medio (aprox. 80%) con 100 ml PDS, 0,25 ml de bFGF (. 20 mg / ml; aprox 0,05%), 0,5 ml de heparina (100 l / ml; aprox. 0,1%) y 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml; aprox. 0,1%). Añadir pyrumycin sólo para medio de cultivo celular utilizado en los primeros 2 días de cultivo. Realizar la filtración estéril en un tubo de vidrio (diámetro de poros del filtro: 0,2 m). Después almacenar la solución a 4 ° C. Recubrimiento de placas de cultivo celular: Para 1 ml de solución de recubrimiento, preparar una solución de 500 l ddH 2 O, 400 l de colágeno IV (0,4 mg / ml) y 100 l de fibronectina (0,1 mg / ml). Cubra toda la superficie de la CAOh pocillo de la placa de cultivo celular con la solución de recubrimiento. Guarde la placa a 4 ° C durante la noche. 4. Aislamiento de células endoteliales microvasculares de cerebro murino (MBMEC) Sacrificio 10 ratones adultos (8 – 12 semanas de edad, C57BL / 6) por dislocación cervical. Después de aislar el ratón-cerebros y tienda en 5 ml de PBS (Advertencia: El trabajo estéril). Retire cerebro tallos, cerebelo y tálamo con un fórceps. Separe las meninges enrollando cuidadosamente el cerebro en un papel secante estéril. Recoge las meninges prosencéfalos libres resultantes. Transfiera los cerebros a un tubo Falcon de 50 ml llena de 13,5 ml de DMEM. Picar el tejido, primero con una pipeta de 25 ml, a continuación, con una pipeta de 10 ml hasta que el medio se vuelve lechoso. Entonces digerir el tejido con una mezcla de 0,6 ml de colagenasa CLS2 (10 mg / ml en DMEM) y 0,2 ml de DNAsa (1 mg / ml en PBS) en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) durante 1 hora a 37 ° C en un orbital sacudirr a 180 rpm. Añadir 10 ml de DMEM añaden a la suspensión de tejido y centrifugar las células a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante (Advertencia: PELLET es fácil perder) Para quitar la mielina, resuspender el precipitado con una pipeta de 25 ml en 25 ml de BSA-DMEM (20% w / v) (aprox. 25 veces), y se centrifuga a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. Desechar la capa de mielina superior (lechosa) con una pipeta Pasteur de vidrio rota con mayor diámetro, y luego desechar la capa de BSA con una pipeta Pasteur normales. Resuspender el precipitado en 9 ml de DMEM y se añade 1 ml de colagenasa / dispasa (concentración final es 1 mg / ml) y 0,1 ml de DNAsa. Digerir la solución durante 1 hora a 37 ° C en un agitador orbital a 180 rpm (advertencia: no utilice la pipeta para volver a suspender – las células se pueden perder). Durante la digestión, centrifugar la solución de Percoll para establecer el gradiente de densidad usando una ultracentrífuga a 3.000 xg durante 1 hora a 4 ° C, con una aceleración, wifreno sn. Añadir 10 ml de DMEM a la suspensión celular digerido. Se centrifuga la suspensión a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. A continuación, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 ml de DMEM. Añadir las células resuspendidas cuidadosamente en la parte superior del gradiente de Percoll y se centrifuga a 700 xg durante 10 min a 4 ° C sin aceleración y freno. Nota: Las células son visibles como una nube en la interfase. Tome aprox. 12 ml de la interfase con las células con una aguja estéril largo y colocarlo en un nuevo Falcon de 50 ml con 5 ml de DMEM. Centrifugar las células de nuevo a 1.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Después resuspender el precipitado en medio de células endoteliales (utilizar aprox. 0,2 ml de medio por 1 cm 2 de superficie de placa de cultivo celular). Retire solución de revestimiento de placas de cultivo celular recubiertas (consulte el paso 3.2) y enjuagar bien con todos PBS estéril en dos etapas de lavado consecutivos. Mantener cultivos celulares in endotelialmedio celular a 37 ° C y CO 2 en un incubador estéril al 5%. Cambiar el medio cada dos o tres días. Dividir celdas en el 90% de confluencia.

Representative Results

Inmediatamente después del aislamiento, BMECs murinos y células contaminantes forman conglomerados que flotan en el medio de cultivo celular (Figura 1A, día 0). El tratamiento con pyrumycin conduce a una selección de BMECs murinos ya que expresan altos niveles de transportadores de eflujo, tales como P-glicoproteína conduce a una resistencia relativa a las toxinas. Células contaminantes son mucho más susceptibles a la citotoxicidad mediada pyrumycin 19. Durante el proceso de selección pyrumicin, células contaminantes entran en la muerte celular apoptótica o necrótica, mientras que MBMECs comienzan a unirse a las colágeno IV / fibronectina recubierto de placas de cultivo celular (Figura 1A, día 1 y día 2). Hasta el día 5, los MBMECs proliferan a una densidad de aprox. 80 a 90%. Se caracterizan por la apariencia típica forma de huso. En la confluencia, que forman una monocapa de células de contacto inhibido que no se superponen perfectamente embalados, alineada longitudinalmente y (Figura 1A, el día 5). Porselección pyrumicin, una alta pureza de hasta el 99% MBMEC se alcanza como se ha demostrado por el marcador de células endoteliales CD31 (PECAM1; Figura 1B). Los MBMECs forman monocapas fuertemente sellados interconectados por proteínas de unión estrecha. Después de 7 – 8 días de cultivo, las capas de células endoteliales se acumulan los valores estables de resistencia eléctrica (alcanzando valores típicos entre 20 – 30 Ω cm x 2). Y la capacitancia (Figura 1C) En este punto de tiempo ensayos funcionales tales como por células experimentos de migración 3, 20,21 y permeabilidad pruebas, por ejemplo, con azul de Evans o dextrano, se deben realizar. Figura 1. morfológica y propiedades funcionales de murino BMECs. (A) curso temporal Representante de BMECs cultivadas vistos por la luz micro transmisiónSCOPY más de 5 días. Barra de escala se aplica para todas las imágenes. (B) La tinción de inmunofluorescencia para el marcador de células endoteliales CD31 en el día 5. CD31 (verde) y DAPI (azul). (C) Las células se precultivaron durante 5 días y luego se transfieren a un sistema automatizado para la análisis de las propiedades biofísicas (resistencia y capacitancia). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Discussion

Disfunción sangre-cerebro-barrera es una característica de diversas enfermedades del SNC deletéreos, por ejemplo, un desglose de la BBB en la esclerosis múltiple facilita ampliamente la invasión del SNC por células inmunes autorreactivas y permite el encuentro y la destrucción de los oligodendrocitos. En el accidente cerebrovascular isquémico la interrupción de la BBB y la subsiguiente formación de edema cerebral son factores críticos que influyen en el crecimiento del infarto secundaria y la supervivencia global de los pacientes 6. Además, por alteraciones de la BBB en áreas remotas lesiones isquémicas focales son capaces de inducir alteraciones funcionales generalizadas del cerebro. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes son en gran medida desconocidos 5. En contraste, la alta densidad y diversidad de transportadores de eflujo en BMECs funcionales reduce la concentración de fármacos beneficiosos tales como agentes quimioterapéuticos para neoplasias cerebrales o antibióticos para enfermedades infecciosas. Por lo tanto, una comprensión más profunda del cerebro-sangre-barSe requiere portador función en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas para desarrollar agentes farmacológicos que son capaces de regular específicamente la función de barrera en la dirección favorecida 21. Pronóstico en modelos in vitro de la acreditación son herramientas indispensables para el estudio de los mecanismos de regulación de la acreditación.

Muchas líneas de células endoteliales inmortalizadas cerebro se han establecido y empleado como modelos in vitro de BBB 22. Estas líneas celulares ofrecen ciertas ventajas sobre BMECs primarias a medida que crecen más rápido y mantienen ciertas características de BBB durante varios pasajes. Sin embargo, las líneas de células endoteliales no pueden sustituir completamente a las células primarias propiedades importantes como son cambiadas que se entremezclan con la transferibilidad de los resultados experimentales a la situación in vivo. Por ejemplo, la línea de células endoteliales del cerebro murino bEnd.5 expresa sólo bajos niveles de proteínas apretado nudo distribuidos de manera discontinua que conducen a alta Paracpermeabilidad ellular 23. BEnd.3, otra línea de células endoteliales del cerebro murino utilizado con frecuencia, demuestra uniones densas y continuas distribuidas ajustados, una alta resistencia transendotelial, varios transportadores de salida y baja permeabilidad paracelular. Sin embargo, las capas de células bEnd.3 en comparación con BMECs primarias carecen de una verdadera discriminación con respecto a la permeación de cierta transcelular y paracelular 24 sustratos.

En las preparaciones de cultivos de células primarias, células contaminantes pueden interferir significativamente con la validez de los resultados experimentales. En el protocolo descrito, pyrumicin se utiliza como un agente selectivo para las células endoteliales para lograr alta pureza. Sin embargo, un control de calidad regular del cultivo celular está inevitablemente necesario para garantizar para los experimentos fiables. Hay varios métodos para el control de calidad, además de propiedades morfológicas típicas de las células endoteliales (véase la Figura 1A), el transendothelial resistencia podría medirse o la expresión de marcador de células endoteliales tales como CD31 (véase la figura 1B) o el factor de von Willebrand (vWF) podría ser evaluado.

El número de células endoteliales cerebrales aisladas a partir de un cerebro de ratón es relativamente baja y para establecer un cultivo celular adecuado para múltiples experimentos, los cerebros de varios ratones tienen que ser agrupado. En nuestra experiencia, al menos 10 ratones necesitan ser utilizado para un experimento que podría ser un factor limitante en función de los recursos de la instalación animal respectivo. Con el fin de evitar sesgos o factores de confusión, sólo los ratones con un fondo genético y ambiental idénticos deben ponerse en común. En contraste, bovino y preparaciones de células endoteliales de cerebro porcino proporcionan un gran número de células endoteliales de cerebro disponibles en una sola cerebro. Sin embargo, además de la cría y la vivienda no complicada, el amplio y creciente repertorio de ratones transgénicos disponibles hace murino primaria BMECs como un idealmodelo para el estudio de la función de la sangre-cerebro-barrera.

Varios hallazgos clave relativos a las funciones de la acreditación y los mecanismos moleculares subyacentes han venido de los estudios en los sistemas de cultivo de tejidos en 2D. Recientemente, los sistemas de cultivo 3D se han desarrollado 25, donde las células endoteliales se colocan dentro de una matriz de colágeno lo que les permite formar lumen y redes tubulares. Estos nuevos sistemas de cultivo celular permiten una reproducción más precisa de los procesos vasculares en el organismo intacto in vivo. La participación de otras células de los NVU en 3D sistemas de cultivo celular, tales como los pericitos y astrocitos podría revolucionar el estudio in vitro de la función sangre-cerebro-barrera; primeros modelos Recientemente se han desarrollado 26.

Hay algunas recomendaciones para la solución de problemas. En primer lugar de trabajo estéril es esencial para la calidad del cultivo celular endotelial. En segundo lugar, pyrumycin sólo se debe agregar para celularmedio de cultivo utilizado en los primeros 2 días de cultivo, la aplicación más larga podría conducir a un aumento de la muerte celular y la función MBMEC barrera baja calidad. En tercer lugar, las enzimas aplicadas en este protocolo deben ser utilizados y almacenados de acuerdo con las instrucciones del fabricante; de lo contrario su función apropiada podría verse comprometida. Además, el revestimiento de placas de cultivo celular puede ser modificado si las células endoteliales no se adhieren. Las concentraciones de fibronectina y colágeno pueden ser cambiados u otras proteínas de la matriz pueden ser añadidos a la solución de revestimiento. Por último, la edad, el género, la temporada de las condiciones ambientales dentro de año y la instalación de animales son factores importantes que pueden influir en la calidad de aislamiento MBMEC y comparabilidad de los experimentos. Asimismo, debe asegurarse de que las condiciones son comparables entre experimentos independientes.

El protocolo descrito debe considerarse como un método para aislar neuroinmunológicas básica BMECs murinos. Las células aisladas pueden ser used para una amplia variedad de aplicaciones para obtener una mayor comprensión de la acreditación función, tal como ensayos de migración, gen y estudios de expresión de proteínas, evaluaciones electrofisiológicas o experimentos de permeabilidad. Como se mencionó anteriormente, los sistemas de cultivo de células en 3D de BMECs podrían proporcionar nuevas oportunidades para estudiar los complejos mecanismos implicados en la regulación de la acreditación en el contexto de la NVU. Por lo tanto, el aislamiento de células endoteliales primarias seguirá siendo una técnica muy valiosa en el campo de la acreditación de investigación en el futuro.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), células en movimiento Cluster de Excelencia (EXC 1003 – CIM), de la Universidad de Münster (a SB y SGM) y por lo demás el Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 a SB y SGM). Damos las gracias a Heike Blum por las excelentes ilustraciones.

Materials

bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A9418 Bovine serum albumine
Collagenase CLS2 Worthington LS004176 High relative level of protease activity
Collagenase-dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV Sigma Aldrich C0543 From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM Sigma Aldrich D5030 Warm in 37 °C water bath before use
DNAse Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin Sigma Aldrich H3393 Anticoagulant
PDS First Link UK Ltd. 60-00-850 Plasma-derived serum
Percoll Sigma Aldrich P1644 Warm to room temperature before use
Pyrumycin Sigma Aldrich P8833 Should only be used in first 2 d of culture
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Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (93), e52204, doi:10.3791/52204 (2014).
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