عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي
Summary
Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.
Abstract
The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.
Introduction
الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الخلايا البطانية (BMEC) شكل الطبقات الوحيدة التي تشكل جزءا لا يتجزأ من درجة عالية من التخصص الدم في الدماغ من العوائق (BBB). مترابطة BMECs من البروتينات صلي تعلق على الغشاء القاعدي. جنبا إلى جنب مع pericytes، وخلايا العضلات الملساء، قدم نهاية نجمي وخلايا الدم يبنون ما يسمى وحدة وعائية عصبية (NVU) 1. ضد فكرة سابقة من حاجز كتيم بين الدم و-عصبي-النظام المركزي (CNS)، وNVU هو واجهة ديناميكية ومحددة للغاية والتنظيم الذي يسيطر على الانتقال من السوائل، والجزيئات والخلايا بين الأوعية الدموية الدماغية والجهاز العصبي المركزي 2 . خلل وظيفي أو التقلبات في NVU قد بدء و / أو المساهمة في مجموعة متنوعة من الوعائية العصبية، والأمراض المعدية، والتهابات أو التنكسية في الجهاز العصبي المركزي، مثل السكتة الدماغية، ومرض الاعتلال الدماغي، والتصلب المتعدد، الزهايمر أو مرض باركنسون 3-6.
_content "> وختم أحادي الطبقة BMEC بإحكام من قبل مجمع صلي تتألف من ضيق (TJ) والملتصقة تقاطعات (AJ) 7. والمقاومة الكهربائية عالية ونفاذية منخفضة paracellular من BBB تقوم أساسا على البروتينات TJ (8). وTJS و المجمعات التي شكلتها البروتينات عبر الغشاء من عائلة claudin وoccludin، التي ترتبط الهيكل الخلوي للخلايا البطانية من قبل جزيئات محول، مثل zonulaoccludens (ZO) البروتينات ZO1-3 4، ويتم تجميعها بشكل رئيسي تقاطعات الملتصقة بها بروتين الغشاء لا يتجزأ الوعائية البطانية (VE) -cadherin، الذي يرتبط الهيكل الخلوي عبر catenins 8.وختم ضيق من BBB يمنع التبادل الحر للركائز والخلايا بين الدم والسائل النخاعي. استثناءات لهذه القاعدة هي محبة للدهون، جزيئات صغيرة ذات وزن جزيئي <400 دا، والتي هي قادرة على عبور BBB من قبل بوساطة الدهون نشر 9. مرور أكبر و / أوجزيئات ماء، مثل الجلوكوز والأحماض الأمينية، والببتيدات والبروتينات والعديد من الأدوية يقتصر على أنظمة رقابة شديدة النقل العابر لل10، والتي يمكن تصنيفها إلى خمس فئات رئيسية هي: النقل بوساطة الناقل، نقل أيون، والنقل هروب رأس المال النشط، بوساطة مستقبلات النقل، وcaveolae بوساطة النقل 4. هذه الأنظمة تساعد على نقل الحفاظ على التوازن للجهاز العصبي المركزي، وهو مطلوب لجيل إشارة دقيقة، التنبيغ والتكامل. وعلاوة على ذلك، BMECs هي قادرة على السيطرة بفاعلية على انتقال الجزيئات متميزة من خلال التعبير عن مجموعة متنوعة من ectoenzymes. يتم ترجمة هذه الإنزيمات على سطح الخلية وتعديل ركائز الداخلية والخارجية التي تعيق أو محددة تسمح بالانتقال من BBB 11.
في حين اعتبر الجهاز العصبي المركزي كجهاز المناعة حظا لفترة طويلة، وتشير النتائج الأخيرة لنظام ديناميكي ومنظم بإحكام بدلا من surv المناعةeillance من الجهاز العصبي المركزي. وBMECs تشارك بشكل حاسم في تنظيم هجرة الخلايا المناعية. من خلال التعبير عن selectins على الخلايا الليمفاوية سطحها والناجم بشكل انتقائي إرفاق فضفاضة إلى البطانة. إفراز كيموكينات التي تواجهها مع مستقبلات معينة على الكريات البيض يؤدي إلى التعبير أو تغيير متعلق بتكوين integrins من الكريات البيض، مثل LFA-1 (وظيفة الخلايا اللمفاوية المرتبطة مستضد 1) وVLA-4 (أواخر جدا مستضد 4). وintegrins توسط في التصاق متين من قبل ملزم counterreceptors البطانية، وعلى سبيل المثال VCAM-I (الأوعية الدموية جزيء التصاق الخلية)، ICAM-I (بين الخلايا جزيء التصاق) تمكين التهجير في لحمة بين الدماغ أو من خلال BMECs من BBB 12-14. هذه النتائج وغيرها تؤكد على الدور النشط للالبطانة نفسها في تنظيم هجرة الخلايا المناعية.
وعلاوة على ذلك، BMECs كما يشارك جزءا من NVU في تنظيم تدفق الدم الدماغي لىnked لمطالب الأيضية العصبية المحلية. على التحفيز نجمي الخلايا تنتج الخلايا البطانية المواد فعال في الأوعية مثل أكسيد النيتريك مما يؤدي إلى التخفيف من خلايا العضلات الملساء الوعائية 15.
الأوعية الدموية والخلايا العصبية في البلدان النامية وكذلك في المعرض الدماغ الكبار الزخرفة موازية والتنمية وتبادل العديد من خصائص التنظيم 1، 4. الخلايا البطانية وتشارك بشكل حاسم في هذه العمليات 16، 17.
باختصار، BMECs توفر ميزات أساسية لتبرير التنمية السليمة وأداء الجهاز العصبي المركزي. يرتبط ضعف BBB إلى العديد من الاضطرابات العصبية الحادة. ومع ذلك، فقد تم التعرف سوى عدد قليل جدا من الأهداف في واجهة الدماغ الأوعية الدموية لعلاج محدد وفعال 18. نماذج مبسطة في المختبر استخدمت لفهم الآليات التي تشارك في تنظيم وظيفة من الأنظمة الفسيولوجية المعقدة للوالوقت نانوغرام. العزلة كما وصفها هذا المخطوط والدراسة في المختبر من الفئران BMECs، نظرا لمجموعة واسعة من الماوس خروج المغلوب-سلالات محددة، قد يوفر المزيد من التفهم لوظيفة BBB والتنظيم في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض فتح آفاقا علاجية جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ضعف الدم في الدماغ من العوائق هو السمة المميزة لمختلف أمراض الجهاز العصبي المركزي الضارة، مثل انهيار من BBB في التصلب المتعدد يسهل على نطاق واسع للغزو من قبل الجهاز العصبي المركزي الخلايا المناعية autoreactive وتمكن من لقاء وتدمير الخلايا قليلة التغصن. في السكتة الدماغية اختلال BBB وتشكيل لاحق من الوذمة الدماغية من العوامل الهامة التي تؤثر على نمو احتشاء الثانوي وبقاء الكلي للمرضى 6. وعلاوة على ذلك، من خلال التعديلات من BBB في المناطق النائية الآفات الدماغية اتصال قادرة على إحداث تغييرات وظيفية واسعة النطاق من الدماغ. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الكامنة غير معروفة إلى حد كبير 5. في المقابل، فإن كثافة عالية وتنوع النقل هروب رأس المال في BMECs ظيفية يقلل من تركيز الأدوية النافعة مثل مبحث المعالجة الكيميائية عن الأورام الخبيثة في المخ أو المضادات الحيوية للأمراض المعدية. لذا، فهم أعمق للدماغ بار الدممطلوب رير وظيفة في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض لتطوير كلاء الدوائية التي تكون قادرة على تنظيم تحديدا وظيفة الحاجز في الاتجاه المفضل 21. يمكن الاعتماد عليها في المختبر نماذج من BBB هي أدوات لا غنى عنها لدراسة الآليات التنظيمية على BBB.
وقد تم إنشاء العديد من خطوط الخلايا البطانية خلد الدماغ ويعمل كما هو الحال في المختبر نماذج BBB 22. هذه خطوط الخلايا توفر مزايا معينة على BMECs الابتدائية لأنها تنمو أسرع والحفاظ على الخصائص BBB معينة على مدى عدة فقرات. ومع ذلك، يمكن للخطوط الخلايا البطانية ليس بديلا كاملا للخلايا الأولية يتم تغيير الخصائص الهامة كما أن تختلط مع إمكانية نقل نتائج التجارب إلى الوضع في الجسم الحي. على سبيل المثال، خط الخلية البطانية دماغ الفئران bEnd.5 عن مستويات منخفضة فقط من البروتينات وزعت متقطع مفرق ضيقة مما يؤدي إلى ارتفاع paracنفاذية ellular 23. BEnd.3، الفئران البطانية الدماغ خط خلية أخرى تستخدم في كثير من الأحيان، يدل على التقاطعات كثيفة ومستمرة بتوزيع ضيقة، ومقاومة transendothelial عالية، عدة ناقلات هروب رأس المال وانخفاض نفاذية paracellular. ومع ذلك، طبقات الخلايا bEND.3 مقارنة BMECs الابتدائية تفتقر إلى التمييز الحقيقي فيما يتعلق تخلل العابر للبعض وركائز paracellular 24.
في الأعمال التحضيرية للثقافات الخلية الأولية، يمكن خلايا تلويث تتدخل بشكل كبير مع صحة النتائج التجريبية. في البروتوكول وصفها، يستخدم pyrumicin كعامل انتقائي للخلايا البطانية لتحقيق نقاوة عالية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مراقبة الجودة العادية للثقافة الخلية حتما إلى ضمان للتجارب موثوقة. هناك عدة طرق لمراقبة الجودة، إلى جانب الخصائص المورفولوجية نموذجي من الخلايا البطانية (انظر الشكل 1A)، وtransendotheliaيمكن قياس لتر المقاومة أو قد يتم تقييم التعبير عن البطانية علامة الخلية مثل CD31 (انظر الشكل 1B) أو عامل فون ويلبراند (VWF).
عدد الخلايا البطانية الدماغ معزولة عن بعضها مخ الفأر منخفض نسبيا وإنشاء ثقافة الخلية المناسبة لتجارب متعددة، العقل المدبر للعديد من الفئران يجب أن تكون مجمعة. في تجربتنا، وتحتاج على الأقل 10 الفئران لاستخدامها في تجربة واحدة التي قد تكون عاملا مقيدا اعتمادا على موارد مرفق الحيوانية منها. من أجل تجنب التحيز أو عوامل خارجية، ينبغي تجميع الفئران فقط مع خلفية وراثية وبيئية مماثلة. في المقابل، البقر والخنزير التحضيرات الخلايا البطانية الدماغ توفير عدد كبير من الخلايا البطانية الدماغ المتاحة في الدماغ واحد. ولكن، إلى جانب تربية غير معقدة، والإسكان، وذخيرة واسعة ومتزايدة من الفئران المعدلة وراثيا المتوفرة يجعل الفئران الأساسي BMECs باعتباره المثل الأعلىنموذج لدراسة وظيفة الدم في الدماغ من العوائق.
وتأتي العديد من النتائج الرئيسية التي تتعلق بوظائف BBB والآليات الجزيئية الكامنة من الدراسات في أنظمة زراعة الأنسجة 2D. مؤخرا، تم تطوير نظم الاستزراع 3D 25، حيث توضع الخلايا البطانية داخل مصفوفة الكولاجين وتمكينهم من تشكيل التجويف والشبكات الأنبوبية. هذه الأنظمة الثقافة خلية جديدة تسمح لاستنساخ أكثر دقة من العمليات الدموية في الكائن الحي سليمة في الجسم الحي. إشراك المزيد من خلايا NVU في 3D أنظمة زراعة الخلايا، مثل الخلايا النجمية وpericytes قد تحدث ثورة في المختبر دراسة وظيفة الدم في الدماغ من العوائق. وقد تم مؤخرا تطوير النماذج الأولى 26.
هناك بعض التوصيات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا وقبل كل عمل عقيم أمر ضروري لنوعية زراعة الخلايا البطانية. ثانيا، ينبغي أن يضاف pyrumycin فقط للخليةمستنبت المستخدمة في الأيام الأولى 2 للثقافة، قد يؤدي إلى زيادة الطلب أطول MBMEC موت الخلايا وانخفاض وظيفة الحاجز الجودة. ثالثا، الانزيمات المطبقة في هذا البروتوكول يجب أن تستخدم وتخزن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. خلاف ذلك قد يثير الشبهة وظيفتها المناسبة. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل طلاء لوحات ثقافة الخلية إذا الخلايا البطانية لا نعلق. قد تتغير تركيزات فبرونيكتين والكولاجين أو قد تضاف البروتينات مصفوفة أخرى إلى حل الطلاء. أخيرا، العمر، الجنس، الموسم الشروط العام والبيئية داخل المنشأة الحيوانية من العوامل الهامة التي قد تؤثر على نوعية MBMEC العزلة والمقارنة بين التجارب. يجب التأكد من أن الظروف قابلة للمقارنة بين تجارب مستقلة.
ينبغي النظر في بروتوكول صفها بأنها طريقة neuroimmunological الأساسي لعزل BMECs الفئران. الخلايا المعزولة قد يكون شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لمجموعة واسعة من التطبيقات للحصول على مزيد من التبصر في وظيفة BBB، مثل فحوصات الهجرة والجينات ودراسات التعبير البروتين، والتقييمات الكهربية أو تجارب النفاذية. كما ذكر أعلاه، نظم زراعة الخلايا 3D من BMECs قد توفر فرصا جديدة لدراسة الآليات المعقدة التي تنطوي عليها تنظيم BBB في سياق NVU. وبالتالي، فإن عزل الخلايا البطانية الأولية تبقى تقنية لا تقدر بثمن في مجال البحث BBB في المستقبل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) مونستر (SEED 03/12، SB)، من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، خلايا الحركة في والعنقودية التميز (EXC 1003 – CIM)، جامعة مونستر (SB لوSGM) وقبل عدا كرونة-فريزنيوس شتيفتونغ (2012_A88 لSB وSGM). نشكر هايكه بلوم للرسوم توضيحية ممتازة.
Materials
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Bovine serum albumine |
| Collagenase CLS2 | Worthington | LS004176 | High relative level of protease activity |
| Collagenase-dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C0543 | From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane |
| DMEM | Sigma Aldrich | D5030 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DNAse | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| FCS | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum (also named fetal bovine serum) |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | Anticoagulant |
| PDS | First Link UK Ltd. | 60-00-850 | Plasma-derived serum |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1644 | Warm to room temperature before use |
| Pyrumycin | Sigma Aldrich | P8833 | Should only be used in first 2 d of culture |
References
- Neuwelt, E. A., et al. Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology. Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).
- Ohtsuki, S., Terasaki, T. Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development. Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).
- Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).
- Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Stoll, G., et al. Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 331-341 (2009).
- Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome. Stroke. 42, 1081-1089 (2011).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).
- Bazzoni, G., Dejana, E. Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis. Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).
- Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).
- Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).
- Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).
- Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, 562-566 (2010).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).
- Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
- Ruck, T., et al. CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation. PLoS One. 8, 81455 (2013).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).
- Watanabe, T., et al. Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).
- Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, 95-112 (2003).
- Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115, 5259-5269 (2010).
- Urich, E., et al. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Scientific reports. 3, (2013).
