Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos<em> In Vitro</em

NOTA: Todos los procedimientos de recogida de sangre que se describen en este método se realizaron de conformidad con la Declaración de Helsinki y aprobado por la UNT junta de revisión institucional (IRB) para los sujetos humanos. Todos los sujetos dieron su consentimiento por escrito para la recogida de sangre, que fue utilizado en el presente método para asegurar que eran aparentemente sanas, de peso corporal normal, y libre de la enfermedad. 1. Reactivo Fuente y Preparación Uso CD66b-APC (clon # G10F5; DF = 1: 50) y CD45-APCeFluor780 (clon # 2D1; DF = 1: 50) para este ensayo. NOTA: Antes del estudio, los anticuerpos CD45 y CD66b se titularon para determinar la dilución óptima que claramente resueltos granulocitos (CD45 + / + 66b) de otros leucocitos (CD45 + / 66b-) 11. Después de la adición del anticuerpo diluido para la tinción de la dilución final en el tubo era de 875. Compra y deshielo stock S. aureus biopartículas etiquetado con pHrodo tinte rojo. Suspender a una concentración de 1 mg de biopartículas por ml en PBS estéril. Biopartículas diluidas alícuotas y almacenar congeladas a -20 ° C hasta su uso en el ensayo. Disolver dihydroethidium (DHE), que se convierte en bromuro de etidio fluorescente de la presencia de radicales libres de oxígeno (es decir, la explosión oxidativa), en DMSO a una concentración final de 10 g / ml. Mezclar N-etilmaleimida (utilizado para evitar la fagocitosis adicional tras el ensayo de duración de incubación indicado) con PBS estéril en una dilución 2 paso de 200 mg / ml y 17,5 mg / ml, respectivamente. En el ensayo, utilizar una concentración final de 15 mM. Al descongelar N-etilmaleimida, use un bloque de calor a 37 ° C, como la N-etilmaleimida no permanece en solución. Después de la etapa de fijación final, utilizar 7AAD para teñir el ADN nuclear. Antes de la adición, se diluye el 7AAD 1:10 con PBS estéril. 2. La sangre recogida de muestras Pregunte sujetos a llegar al laboratorio después de una O / N rápido (> 8 horas) y abstentidesde la actividad física (> 12 h). Después de limpiar la piel con una almohadilla con alcohol, inserte una aguja estéril de recolección de sangre en una vena periférica del brazo. Recoger la sangre en tubos evacuados que se llenan comercialmente con heparina sódica. Después de la recogida, aplique una venda adhesiva en el brazo del sujeto. Invierta tubos de sangre para mezclar 10 veces y luego se coloca en un agitador hasta su análisis. 3. Ensayo de fagocitosis Técnica Biopartículas Descongelar S. aureus (RT), DHE (RT), y N-etil-maleimida (37 ° C). Añadir 20 l de biopartículas S. aureus a 4 individuales 1,2 ml tubos mientras se trabaja en la campana estéril. Añadir 40 l de DHE a cada tubo que contiene las biopartículas. Golpear suavemente los tubos sobre la superficie del banco para recoger los reactivos en el fondo del tubo. Añadir 100 L de sangre entera mixta a cada tubo que ha sido llenado con biopartículas y DHE. Limpie el borde interior de los tubos con un aplicador con punta de algodón para eliminar la sangre contaminante. Mezclar la sangre y los reactivos con una pipeta electrónica programada para mezclar la sangre y reactivos para tres ciclos después de la adición de la sangre. Coloque los tubos de ensayo en un cubo de hielo y la cubierta para protegerla de la luz. Incubar los tubos de ensayo de 10, 20, y 40 min. Iniciar con el tubo 40-min para asegurar que todos los tubos de ensayo terminan al mismo tiempo. Descongele la N-etilmaleimida en 37 ° C baño de grano. Pipetear 15 L de N-etilmaleimida (descrito anteriormente en 1.4) en cada tubo de ensayo, se incuba durante 30 min. Pipetear 10 L de CD66b-APC y 10 L de CD45-APCeFluor780 anticuerpos diluidas (descritos anteriormente en el punto 1.1), se incuba durante 60 min. Pipetear 750 L de solución de lisis CMB fix / RBC en cada tubo de ensayo, se incuba durante 60 min. Se centrifuga (10 min a 400 xg) tubos de ensayo para recoger el sedimento celular. Vacío aspirar la solución de lisis WBC / RBC solución, dejando un fl residualvolumen uid (100 L) por encima del sedimento celular. Pipetear 10 L de solución diluida 7AAD (descrito más arriba en 1.5) y 50 L de PBS en cada tubo de ensayo. Añadir una gota de bolas de calibración (~ 25 L) a cada tubo de ensayo, colocar tapones en los tubos de ensayo, tubos de envoltura en papel de aluminio y colocar en un refrigerador. Cargue el tubo de la muestra en el flujo basado en imágenes citómetro y recoger un mínimo de 3.000 eventos de granulocitos utilizando parámetros predefinidos: Automuestreador, azul (488 nm; 60 mW), rojo (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) láser (Figura 1). Figura 1. Método y Plantilla de Adquisición. Las muestras fueron adquiridas en un flujo basado en imágenes citómetro (A). Durante la adquisición, gráficos de puntos de relación de aspecto brillante Campo vs. CD66b-APC se generaron a granulocitos separados de bolas de calibración de pinchos using INSPIRE v. 100.2.292.0 software (B). Un mínimo de 5.000 granulocitos fueron adquiridos para cada muestra utilizando un inyector automático, azul (488 nm; 60 mW), rojo (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) láser. Tenga en cuenta que una serie de histogramas están presentes durante la adquisición de los ajustes de monitor láser y otros aspectos de los datos coleccionar. Todos estos histogramas son opcionales y sólo es necesario si los procedimientos de operación estándar de laboratorio que requiere el control de calidad. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Muestra Adquisición y Análisis Utilice el asistente de compensación software automatizado del software IDEAS aplicar una matriz de compensación a los archivos de imagen RAW (RIF) y crear archivos de compensar la imagen (CIF). Cargar archivos CIF individuales en el software de IDEAS y generar las siguientes parcelas para identificar los subgrupos de granulocitos: </li> Establecer puertas iniciales para identificar las células que se consideraban en el enfoque mediante un histograma de brillantes RMS gradiente de campo (Figura 2A). Hacer esta determinación para cada muestra utilizando el control sin estimular como patrón de referencia. Usar tramas secundarias a células singlete separados de los desechos y dobletes utilizando un gráfico de puntos de campo brillante relación de aspecto (relación de altura de las células frente a la anchura) vs. área de campo claro (Figura 2B). Hacer esta determinación para cada muestra utilizando el control sin estimular como patrón de referencia. Una vez que se había identificado una población limpia de células, establecer un diagrama de puntos de CD45 vs. CD66b (Figura 2C) para identificar positivamente los granulocitos (CD45 + / + 66b). Crear una parcela hija (Figura 3) de intensidad detalle brillante para S. aureus (eje x) frente a la intensidad de detalle brillante para el estallido oxidativo (DHE, eje y) para identificar subconjuntos de granulocitos activados. Recoger brimágenes de campo ight en el canal 1 y 9, biopartículas en el canal 2, DHE en Channel 4, 7AAD en Canal 5, CD66b en el canal 11, y CD45 en el Canal 12. Figura 2. Plantilla de análisis. Esta cifra la serie de parcelas que se generaron para identificar las células que estaban en el foco (A), las células individuales (B), granulocitos (C). Se utilizaron parcelas adicionales para identificar los tres subgrupos de granulocitos activados vs. granulocitos inactivos. Se completó Todos los análisis de archivos de imagen adquiridos utilizando software IDEAS v.6. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.