Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin<em> İn Vitro</em
Summary
This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Abstract
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Introduction
Granülositler işgalci antijenlere karşı ilk savunma hattını sağlar vücudun doğal bağışıklık sisteminin bir bileşeni temsil eder. Granülosit fonksiyonu değerlendirmede Önceki yöntemler granülositler 1-4 değişti nasıl zor topluca tespit yapma, ayrı yöntem kullanılarak fagositoz kapasitesi veya oksidatif patlama üzerinde duruldu. Akış alanındaki gelişmeler, sitometrisi veren yüksek işleme kapasiteli bir şekilde 5 hücrelerin yüksek çözünürlüklü, renkli görüntüleme kapasitesine sahip tezgah üstü aletleri üretimi ile sonuçlanmıştır. Geleneksel akışı ile görüntüleme birleştirmek için yeteneği sitometri yöntemleri sitometri mevcut akış içinde yenilik ve bağışıklık sistemi ile ilgili yeni bilgiler elde etmek gerekli teknolojik bir platform sağlayan bir gelişmeyi temsil etmektedir.
Son on yılda, diğerleri arasında, bizim laboratuar, hevesle çeşitli beslenme ve egzersiz tedavileri patte etkisi üzerinde durulmuşturDoğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu 6-9 RNS. Bu yazıda gösterdiği yöntem, klinik immünoloji alanındaki pratik etkileri vardır. Bu yöntem aynı zamanda bakteriyel parçacıklar ve oksidatif patlama fagositozunu ölçmek için görüntü tabanlı akış sitometri gücünü güçlendirir. Bu yaklaşımı kullanarak, bir analiz görüntü tabanlı bölümü tarafından sağlanan değişkenleri kullanarak aktive granülositleri ayırmak mümkün değildir. Bu alt kümeler bireysel granülositlere hücresel görüntüleri değerlendirirken sonra sadece tanımlanabilir vardı. Daha fazla tahlil inkübasyon süresi üç aktivasyon alt grupları 10 arasında geçişi etkilemiştir. Böylece, birden fazla inkübasyon sürelerinde kullanımı yöntemi, belirli bir deneysel tedavi aşağıdaki granülosit fonksiyonu değişikliği test etmek için izin verebilir olması akla yakındır. Bu yazının amacı, aynı anda oksidatif işlem ile fagositoz ölçmek için görüntü tabanlı akış sitometrik kullanarak değerlendiren granülosit fonksiyonu bir yöntem göstermektiive patladı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem 1,3,4,12-14 flow sitometri kullanılarak granülosit fonksiyonunun değerlendirilmesi için mevcut yöntemler arıtma temsil eder. Bu deneyde kritik adım bioparticles ve DHE kan numunesinin uygun karıştırma ile ilişkili olma eğilimindedir. Eksik karıştırma doğru sonuçlara neden olur. Tam karıştırma kritik olsa da, karıştırma yöntemi doğada yumuşak olmalıdır. Bir karıştırma fonksiyonu yerine, bir girdaplı karıştırıcı ile bir elektronik pipet kullanılarak gerçekleştirilebilir karıştırma önerilmektedir. Tahlilde bir başka kritik adım her zaman tahlil borusunun üst yarısını kirlenmesine neden kan yoktur sağlamaktır. Bu kalıntı kan steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak temizlenebilir. Başarısızlık un-lize kırmızı kan hücreleri ile son tahlil hazırlık kirletebilir bunu çünkü tamamen çıkarılması önemlidir.
Bu yöntemi, uygun dengeleme kontrol kullanmadan önce sp kontrol etmek için ilave edilmelidirgranülosit fonksiyonu çeşitli yönlerini tanımlamak için kullanılan reaktifler arasında ectral örtüşme. Bu yöntem için, dengeleme kontrol 40 dakika deney inkübasyon önerilen ve daha sonra tek bir işaretleyici ile etiketleme gibi kan örnekleri toplamak içerir (yani, E. coli, DHE'nin, vs.). Etiketlemeden sonra, tek pozitif vaka toplanmış ve bir telafi matris Fikirler analiz yazılımı içinde otomatik bir sihirbaz kullanarak oluşturulur. Bu deney kullanılırsa, uygun tazminat kontrolleri Uygun test performansının sağlanması için tamamlanmış olması önemlidir.
Analiz parlak detay yoğunluğu popülasyonları ayırmak için en iyi değişken olduğunu belirlemek ve aynı zamanda çok örtüşme oksidatif patlama ve fagositoz sinyalleri arasında mevcut nasıl tanımlamak için özellik bulucu ve ortak yerelleştirme sihirbazları kullanılarak gerçekleştirilir. Özellikle, görüntü tabanlı sitometri kullanımı üç alt kümeleri içine aktif granülositleri ayırmak yeteneği sağladı. TOnun alt kümesi arıza oksidatif patlama vs fagositoz parlak detay yoğunluğu kullanılarak belirlenmiştir. Tekil hücre fonksiyonlarını incelemek ek olarak, aynı anatomik konum (eş-lokalizasyonu) 'de, aynı zamanda her iki olayı sergilenen hücreler tespit edilmiştir. "Yüksek-aktif" alt kümesi içine düştü granülositler fagositoz ve oksidatif patlama arasında tutarlı ortak yerelleştirme gösterdi tek fenotip vardı. Aktive granülosit alt gruplarının Bu tanımlama giderme gerekli büyük alandır. Yeni bir kullanıcı FİKİRLER örnek süreç iş akışı anlamak için zaman ayırın ve görüntüleme bileşenini kullanarak hücre popülasyonlarının yolluk mekaniğini anlamak için çok önemlidir. Bir kullanıcı yapmak isteyebilir Diğer değişiklikler alternatif veya ek tahlil inkübasyon sürelerinde seçimini içerir. Mevcut yöntem 10-40 dakika süreleri kullanımını önerir; Bununla birlikte, deney modeline bağlı olarak, bu yöntem, buradakullanılmak üzere, daha uzun deney süreleri belirlemek için gerekli olabilir. Böyle bir değişiklik bireysel olarak değerlendirilmesi gerekir.
Ayrıca bu tahlil inkübasyon süresi üç aktive alt kümelerinin görünümü üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu raporda açıklanan yaklaşım daha önce granülosit fonksiyonu 3,4,13,15 ilgili elde edilebilir hangi bilgilerin bir uzantısı temsil eder. Diğer laboratuvarlar dokunulmazlık ve hastalığın 15-17 kapsamlı bir değerlendirmesinin bir parçası olarak granülosit fonksiyonu değişiklikleri değerlendirmek önemini göstermiştir. Bu tahlilin potansiyeline rağmen bu da kısıtlı tarafları yok değildir. Büyük sınırlamalar biri yüksek numune hacmi işleme ile ilişkili maliyet ve zaman talebidir. Bir çalışma tasarımı, belirli bir günde numune çok sayıda gerektirdiğinde, bu işleme tabi tutmak zor olabilir. İşleme elektronik pipetleri ve dağıtıcılar kullanımı ile aerodinamik,ancak bu pahalı olma eğilimindedir ve her laboratuarda mutlaka mevcut değildir.
Araştırma alanımız egzersiz ve beslenme alışkanlıkları bağışıklık sistemi sağlığını etkileyen ve 6,8-10,18-20 işlev nasıl bir çalışma üzerinde duruluyor. Bu tür hedefler, insan sağlığı alanlarında çeşitli önemli pratik etkileri vardır. Fagositoz fonksiyonu izlenmesi tedavi sonuçlarının kritik olduğu egzersiz ve beslenme etkileri çalışmanın ötesinde, bu yazının gösterdiği fagositoz yöntemi klinik immünoloji diğer alanlarda yararlı olabilir. Bu deney potansiyeli ile immünolojik testler sitometrede bir görüntü tabanlı akıştan olabilir olabilir eşsiz görüntüleme bilgileri avantajlarını alarak yeniden icat edilmesi pek çok ilki.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
References
- Kong, M., et al. The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes. Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).
- Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response. J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).
- Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms. Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).
- Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
- McFarlin, B. K., et al. A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children. Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).
- McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).
- Strohacker, K., et al. Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).
- Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. Baker’s yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk. Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (1002).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).
- Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes. Cytometry. 17, 294-301 (1994).
- Gullstrand, B., et al. Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus. J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).
- Fierro, M. T., et al. Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections. Dermatology. 224, 323-330 (2012).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S. Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay. J. Vis. Exp. , (2014).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. Baker’s Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise. J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain. Comp. Med. 62, 462-465 (2012).
