In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

West-Nijlvirus (WNV), een neurotropisch, plus-voelde flavivirus, is een opkomende bedreiging voor de volksgezondheid. Op dit moment zijn er geen vaccins zijn goedgekeurd voor menselijk gebruik ^1. Een verzwakte WNV stam, die een P38G substitutie in het niet-structurele (NS) 4B eiwit, bekend geen letaliteit bij muizen maar hogere aangeboren cytokinen en T cel responsen in muizen dan wildtype WNV NY99 stam ² induceren. Muizen geïmmuniseerd met de NS4B-P38G mutant werden allemaal beschermd tegen een secundaire uitdaging met dodelijke wild-type WNV. Dit suggereert dat de NS4B-P38G mutant geschikte kenmerken voor een ideaal vaccin kandidaat. De mechanismen waarmee de NS4B-P38G mutant induceert hoge beschermende adaptieve immuniteit is nog niet duidelijk begrepen. Toll-like receptoren (TLR's), die pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen te herkennen, spelen een essentiële rol in de initiatie van aangeboren immuniteit tegen virale infectie. De kern TLR signaalweg maakt gebruik van myeloïde differentiatie primaire reactie gene 88 (MyD88) als de primaire adapter ^3,4. In een recente studie werd MyD88 signalering blijkt een belangrijke rol in de ontwikkeling van celgemedieerde immuniteit spelen tijdens WNV NS4B- P38G mutante infectie bij muizen ^5. Dendritische cellen (DCs) zijn één van de belangrijkste antigeen presenterende cellen vertonen de unieke capaciteit tijdens virale infectie ^6,7 primaire T-cel responsen leiden. CD4 ⁺ en CD8 ⁺ T-cellen dragen bij tot langdurige beschermende immuniteit en zijn belangrijk voor gastheer overleven na wildtype WNV infectie ^8,9. Twee immunologische assays werden bij dit onderzoek naar de functie van deze cellen in de NS4B-P38G mutant geïnfecteerde muizen te beoordelen.

Eerst werd een in vitro T-cel priming assay gebruikt ter vergelijking de antigenpresenterende vermogen van DCs van WNV-geïnfecteerde wildtype en MyD88 ^{– / –} muizen. Om de gevoeligheid van de assay, naïeve CD4 <vergrotensup> + T-cellen werden geïsoleerd uit OTII transgene muizen, die een Vα2 / Vβ5 TCR specifiek voor de kip ovalbumine (OVA) peptide uitdrukken 323 – 339. DC's van WNV geïnfecteerde muizen werden gezuiverd, en co-gekweekt met carboxyfluoresceïne succinimidyl Pasen (CFSE ) -gemerkte CD4 ⁺ T-cellen in aanwezigheid van OVA-peptide. Na 5 dagen van co-kweek werden de cellen geoogst en met paraformaldehyde (PFA) vastgesteld en door flow cytometrie geanalyseerd. Proliferatieve assays zijn vanouds door incorporatie van 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) of getritieerd thymine deoxyriboside ⁽³ HTdr) ¹⁰ uitgevoerd. Toch zijn deze testen zijn ofwel radioactief en / of die bijzondere apparatuur in bioveiligheidsniveau (BL) 3 faciliteiten waar WNV studies worden uitgevoerd. De flowcytometrische analyse van lymfocyt proliferatie door seriële halvering van de fluorescentie-intensiteit van de vitale kleurstof CFSE geworden vaker gebruikt in immunologische assays de kleurstof stabieleren gelijkmatig opgenomen in cellen, gemakkelijk gedetecteerd door flow cytometrie en is nonradioactive ^11. De test heeft ook de mogelijkheid om het aantal celdelingen beoordelen. Een groot voordeel van deze assay in WNV studies is dat fixatie van de geïnfecteerde cellen met 1-2% PFA WNV ^12, die monsterverzameling mogelijk maakt met een flowcytometer in BL2 laboratorium kunnen inactiveren.

Vervolgens werd een gemodificeerd intracellulaire cytokine kleuring (ICS) procedure gebruikt om de rol van MyD88 signalering in regulatie van WNV specifieke T cel responsen in NS4B-P38G-mutant geïnfecteerde muizen te bestuderen. In deze test werden splenocyten geïsoleerd uit geïnfecteerde muizen behandeld in vitro met WNV specifieke peptiden. Brefeldine A werd toegevoegd aan de cytokinen in de cel behouden. Na 5 uur incubatie werden cellen geoogst, gewassen en gekleurd voor T cel subsets. Cellen werden vervolgens gefixeerd in PFA, gepermeabiliseerd en gekleurd voor interferon (IFN) -γ en geanalyseerd met flow cytometrie.Zoals bij andere flowcytometrie gebaseerde bepaling, wanneer de cellen worden behandeld met fixatie en permeabilisatie buffer met PFA, geïnfecteerde monsters kunnen worden overgebracht naar een BL2 laboratorium voor verdere verwerking en analyse. In verschillende gepubliceerde studies, hebben we gebruik ICS T celeffectorfuncties meten WNV-geïnfecteerde muizen ^13,14. Hoewel het goed gevestigd, een belangrijk nadeel van deze test is dat de procedure zeer langdurig en tijdrovend wanneer deze binnen BL3 voorzieningen kunnen zijn. Hier werd een micro-centrifugebuis ICS-methode getoond haalbaarder, gemakkelijker te gaan en minder tijdrovend wanneer deze binnen een BL3 laboratorium zijn.