Fluorescentie gebaseerde Monitoring van PAD4 activiteit via een Pro-fluorescentie Substrate Analog

Een groot aantal zoogdiereiwitten worden sterk veranderd door de werking van enzymen na de biosynthese van eiwitten door het ribosoom. Deze post-translationele modificaties (PTM) kan verhogen de functionele diversiteit van het proteoom door de grootte, lading, structuur en oligomerisatie toestand (naast andere functionaliteiten) van eiwitten ^1-3. Hierdoor kan de verandering in eiwitstructuur leiden tot fysiologische gevolgen, zoals proteïne afbraak, cellulaire differentiatie, signalering, modulatie van genexpressie en eiwit-eiwit interacties. Hoewel deze wijzigingen heersen in een groot percentage van alle menselijke eiwitten, de uiteinden van histon eiwitten ondergaan een ongewoon hoog aantal covalente ⁴ modificaties. Histon eiwitten zijn een familie van structurele eiwitten die de condensatie van genomisch DNA te vergemakkelijken. Covalente modificaties van de ongestructureerde histon staarten worden uitgevoerd en gereguleerd door een series van enzymen die de covalente modificatie van residuen (schrijvers) kan katalyseren, reverse dezelfde modificaties (gummen), en onderscheid te maken tussen de veranderingen die zijn bedrukt op de histon staarten (lezers) ^5-7. De meeste van de bekende PTMs mogelijk binnen dit korte segment van de histon zoals methylatie, fosforylatie, acetylatie, sumoylation, ubiquitinatie en citrullinatie ^8.

Citrullinatie Daarbij worden peptidyl-arginine aan de niet t RNA gecodeerde peptidyl-citrulline (figuur 1A). De eiwitten, die verantwoordelijk is voor deze zijketen neutralisatie, lid van de PAD (p eptide een rginine d eiminase) eiwitfamilie, die allemaal calciumafhankelijke enzymen. ^9,10. Tot op heden hebben vijf leden van de PAD familie beschreven (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 en PAD6). Ieder lid van deze familie lijkt te onderscheiden cellulaire eiwitten richten en toont ook unique weefsel distributie profielen. PAD4 is het enige lid van deze eiwitfamilie bekende gelokaliseerd in de kern via een nucleaire lokalisatie sequentie ^11. Dienovereenkomstig is aangetoond dat een aantal nucleaire doelen, waaronder arginine zijketens op de N-terminale staarten van histonen H2A arginine residu 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 en H3R26) en H4 (H4R3) ^{12 deiminate, 13.} Terwijl elk van de PAD isozymen specifieke en kritische fysiologische functies heeft PAD4 veel meer aandacht gekregen vanwege zijn rol in een aantal menselijke processen zowel zieke en gezonde cellen. Recent PAD4 bleek een lid van de pluripotentie transcriptionele netwerk ¹⁴ zijn. Beide PAD4 expressie en activiteit werden getoond tijdens de herprogrammering en de grondtoestand pluripotent staten bij muizen te worden verheven. Door regeling van de regulatie van stamcellen genen kan PAD4 een cruciale rol in de cellulaire herprogrammering efficiency behouden. PAD4 is ook geïmpliceerd in devorming van neutrofiele extracellulaire vallen, die na binding van pathogenen in staat hun systeem klaring. De hypercitrullination histon eiwitten door PAD4 induceert decondensatie van het chromatine, dat als grondstof voor de inkapseling van pathogene bacteriën door de extracellulaire val, waardoor afweren bacteriële infecties ^15,16.

Daarnaast is gebleken PAD4 een actieve rol in een aantal menselijke ziekten. Eerder is aangetoond dat afwijkende expressie van PAD4 geassocieerd met het begin en de ernst van reumatoïde artritis, ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson en multiple sclerose ^17. In feite is de aanwezigheid van anti-eiwit antilichamen gecitrullineerde is een van de meest betrouwbare en definitieve diagnostische en prognostische biomarkers van reumatoïde artritis ^18. Evenzo heeft ontregelde activiteit PAD4 recent waargenomen in een aantal menselijke tumoren zoals eierstok-, borst-, long-, eend slokdarm kanker ^19-22. Het verband tussen PAD4 en kanker een gemedieerd via ELK1 oncogen of via het p53 tumor suppressor eiwit ^22,23 en eerder werk heeft gesuggereerd dat PAD4 een nieuwe anti-kanker therapeutische target ^17,24,25 kunnen zijn. Als proof of principle studie, de uitputting van PAD4 via shRNA in de colorectale kanker cellijn HCT116 werd geopenbaard voldoende voor het induceren van apoptose en celcyclus ²⁶ te zijn. Een recent ontwikkelde PAD4 irreversibele remmer tot een zeventig procent reductie in tumormassa bij muizen ^27. Opmerkelijk genoeg PAD4 remming bleek als een doelgerichte therapie die resulteerde in selectieve doden van kankercellen terwijl spaarde ongetransformeerde cellen.

Het gebruik van kleine moleculen de functie van PAD4 uitschakelen kan blijken een krachtige nieuwe strategie om kankercellen richten of bestaande chemotherapieën ²⁸ vergroten zijn. Helaas, een potent omkeerbare PAD4 remmer moet nog worden ontdekt. Een aantal covalente remmers zijn ontwikkeld met behulp van de chloor / fluor imidine handvat dat de arginine substraat ^27,29,30 nabootst en hebben bewezen praktische hulpmiddelen zijn in het begrijpen van de rol van PAD4 bij zowel gezonde als zieke toestand cellen. Echter, deze moleculen remmen alle actieve PADS met gelijke potentie. Daarom is de behoefte aan een gemakkelijke test die rapporteert over de activiteit van PAD4 cruciaal. Tot op heden zijn PAD4 assays beschreven die de afgifte van ammoniak verbinden van de reactie op een colorimetrische uitlezing ^31, uitgerust met een fluorescent gemerkt chloroamidine substraat analoog voor fluorescentie polarisatie assay ³² gebruikmaken van de zuur-ondersteunde reactie tussen glyoxal en citrulline ^33, en koppel de PAD4 activiteit om een fluorescentie dequenching stap ^34. Hiervan alleen de covalente modifier haloacetamidine strategie gebleken geschikt high-throughput sch tetanen platforms ^32,35,36. We beschrijven een facile fluorescentie gebaseerde test die betrouwbaar meet de activiteit van PAD4. De test, die een sterk signaal-ruisverhouding, analysesnelheid en robuustheid van meting toont, heeft het potentieel om een ​​echt krachtige en selectieve remmer PAD4 ontdekken.