渗透离心技术质外体中提取植物液使用叶<em>菜豆</em>为例

注意：起始叶材料和植物生长的条件标准化的选择是至关重要的，因为这些因素会大大影响质量，可变性和AWF的产率（ 图1）。参数考虑示于表1，并在更详细地讨论了讨论。 参数例如标准化 菜豆 龙lycopersicum 拟南芥 叶型第一片真叶，完全展开，健康从底部开始第 2 次和第3 次叶子，4最大的单张拍摄没有用于质外体提取单张顶完全展开的莲座叶株龄 21天 7 – 9周</tD> 7周一天中的时间光周期中间（12:00） 光周期中间（12:00） 光周期中间（12:00） 水化所有的植物浇水以及1小时收获前所有的植物浇水以及1小时收获前所有的植物浇水以及1小时收获前光 16小时光照，400微摩尔米-2秒-1 16小时光照，400微摩尔米-2秒-1 从第2周10小时光照（短天），400微摩尔米-2秒-1 湿度 70％ 70％ 70％ 温度 22°C的光，18℃的黑暗 22°C的光，18℃的黑暗 21°C 表1.标准化帕拉梅例子TER值在AWF提取使用的叶子。 1.生成质外体洗涤液注：在本协议危险materila从病叶inculding病原微生物不应枉然;而正确的处置程序，应该使用。 选择基于叶片大小设备： 使用无针注射器潜入小叶子（ 如拟南芥，大豆）。使用真空瓶渗透的叶子是太大，不适合在注射器。用保温瓶方法同时渗透多个叶子。 划分的叶子是太大了可用渗透法成用刀片更小的部分。在蒸馏水中彻底冲洗干净切叶的部分在渗透之前删除从受损细胞胞浆散发出的污染物。 使用60毫升注射器叶浸润： 分离从叶植物在使用刀片的叶柄。对于复叶，如西红柿，分离传单的小叶柄。 冲洗通过浸没在新鲜切下叶中蒸馏水以除去叶表面污染物。用吸水纸或纸轻轻吸干干燥叶。 衡量浸润前的叶重。 小心移动和/或叶折入60ml的注射器中，并填充用蒸馏水的注射器（其他渗透流体也可以使用，见讨论）。弹出任何空气注射器内，同时降低柱塞约40亳升位置。 覆盖注射器尖端与任一戴手套的手指或一块封口膜，然后，通过向外拉动柱塞至60毫升标记创建所述注射器内的负压。慢慢松开柱塞。 注意：快速释放的压力可能会导致细胞裂解和细胞质污染。 拔出注射器尖端和弹出的空气，然后重新插入提示，按在柱塞进一步向下创建的正压适度量。 重复步骤1.2.5 – 1.2.6，直到叶子完全渗透，看到的渗透领域的黑暗色彩。 取下注射器叶。轻轻但彻底吸干用吸水纸叶去除表面的液体。 测量渗透叶的重量。之前和浸润其中近似于渗透体积后计算的重量差。 叶浸润保温瓶： 分离从植物的叶，在使用刀片的叶柄。 冲洗通过浸没在新鲜切下叶中蒸馏水以除去叶表面污染物。用吸水纸轻轻吸干干燥叶。 衡量浸润前的叶重。 放置叶（或叶片如果浸润多个叶）在250毫升或更大的侧臂烧瓶共ntaining蒸馏水（其他渗透流体也可以使用，见讨论 ）。完全覆盖叶片与液体。 施加真空烧瓶中。轻轻搅动，以从叶释放气泡。小心缓慢地释放真空。 注意：快速释放的真空可能会导致细胞裂解和细胞质污染。 重复步骤1.3.5直到叶子完全渗透，所看到的渗透区的变暗颜色。 取下烧瓶叶。轻轻但彻底吸干用吸水纸叶去除表面的液体。 测量渗透叶的重量。之前和浸润其中近似于渗透体积后计算的重量差。 恢复AWF通过离心： 将叶上的一块4英寸（10厘米）宽的封口膜。使用5ml的枪头（或类似的大小的对象），卷起的封口膜中的叶。 插入卷起叶与枪头到20ml的注射器中。位置朝上任意裁剪叶边。将注射器放入干净50毫升聚乙烯或聚碳酸酯管。 离心管内的注射器10分钟，在1000×g离心以吊桶式转子在4℃下。 注：以下离心叶片目视检查应表明，大多数的渗透液已被开除。深绿色的补丁指示需要额外离心时间。 吸取回收的AWF到新的1.5mL管。 注：AWF的体积应约匹配的渗透量为叶;如果卷是小于额外离心时间或离心速度是必需的。 离心AWF样品在15000×g离心5分钟，以除去任何细胞或颗粒物质。可替代地，通过AWF通过0.22微米的过滤器，以字符型已经细胞和颗粒物质。 吸取上清到一个新的试管中。继续冰样品，直到存储。 存储AWF样品在-80℃。 2，测定的细胞质污染置于冰上的AWF样本，以尽量减少酶反应（ 如水解），并进行化验后，立即离心步骤完成。 注：对于代谢物测定，样品可以立即提取后冷冻并储存在-80℃直至使用。 对于一个标准的苹果酸脱氢酶（MDH）分析方案看15;否则使用市售的苹果酸脱氢酶检测试剂盒。 对于标准葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）分析方案看16;否则使用市售的G6PDH检测试剂盒。 对于细胞质代谢产物如葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），使用GC-MS进行定量，在步骤5中描述的</stroNG>。否则，使用市售的套件G-6-P的直接检测。 质外体稀释因子3.计算准备两卷步骤1.2.4或1.3.4（例如，蒸馏水）上面所用的渗透液。添加靛蓝胭脂红粉末以1溶液至50μM的终浓度，没有添加到其他。 测量吸光度在200微升用酶标仪的靛蓝胭脂红溶液浸润的610纳米（OD 610）。减去OD 610 200微升的渗透解决方案，而靛蓝胭脂红更正此值。替代这次修正值作为OD 610infiltrate到下面的等式。 执行至少三次重复的叶的渗透与上述（ 步骤1.2或1.3）与两个浸润溶液（有和没有靛蓝胭脂红）。 后浸润，R樱雪的叶子在蒸馏水中，以除去任何剩余的靛蓝胭脂红本的外表面上。 用离心继续为上述（ 步骤1.4）。 确定平均OD 610 200微升靛蓝胭脂红AWF提取的。更正此值减去200微升的靛蓝胭脂红免费AWF平均OD 610值。替代这次修正值作为OD 610AWF到下面的等式。 从校正的吸光度值作为计算稀释因子（ 即，倍稀释）： 质外体稀释倍数= OD 610infiltrate /（OD 610infiltrate – OD 610AWF） 从AWF乘以稀释因子乘法浓度或活性值来估计所述浓度/活性在质外体的流体在植物 。 AWF 4.要集中力量全面通过冷冻干燥打开冷冻干燥器和一llow它在工作温度和压力下，以稳定。 池的新鲜或存储AWF样品所需量。 均匀分布的样本中2毫升离心管中。 确定重建容积： 重构体积=前冷冻干燥/质外体稀释系数体积用盖子封闭，冷冻在液氮中的管中。 转移冷冻管到一个或多个激冷冷冻干燥容器。在传输管道，更换一个已经刺穿了尖锐的物体，使气体交换的盖子。 附加容器到冷冻干燥器并完全冻干的样品。 从机器中取出样品，并通过加入蒸馏水计算量重构AWF。 更换未穿孔盖子和储存样品在-80℃下。 5.代谢物分析的气相色谱质谱法17 <OL> 吸移管将200μlAWF到1.5ml试管加入700微升甲醇中含10微克/毫升核糖醇作为内标。 热，在70℃下进行10分钟。 离心机在11000×g下10分钟。 转移700微升上清液至新的1.5毫升管。 添加375微升冷氯仿和涡持续10秒。 加入500μl卫生署2 O，涡旋10秒。 离心15分钟，在2200×g下。 转移150微升上层水层的成新的1.5毫升管，然后完全干燥的试样在真空中浓缩无热量。 溶解于30μl吡啶含20毫克/毫升的甲氧基胺盐酸盐的样品。 孵育在70℃，同时摇晃剧烈搅拌2小时。 添加50微升MSTFA（N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺）的。 孵育在37℃，同时摇晃30分钟。 转移样品GC-MS补偿atible玻璃小瓶。 执行样本的GC-MS分析。参见李赛克等人，2009年17，上GC-MS设备安装和性能细节。