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생물학

La technique d'infiltration-centrifugation pour l'extraction de apoplastique Fluid feuilles des plantes Utilisation<em> Phaseolus vulgaris</em>, Un exemple

Published: December 19, 2014
doi:
10.3791/52113
, , , ,
1Department of Plant Sciences,University of Oxford, 2School of Education of Vitoria-Gasteiz,University of the Basque Country (UPV/EHU), 3Biosciences,University of Exeter

Summary

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Abstract

Le apoplaste extracellulaire est un compartiment distinct dans les tissus végétaux qui se trouve en dehors de la membrane plasmique et comprend la paroi cellulaire. Le compartiment apoplastique des feuilles des plantes est le site de plusieurs processus biologiques importants, y compris la formation de la paroi cellulaire, nutriment cellulaire et l'absorption de l'eau et de l'exportation, les interactions plantes-endophytes et réactions de défense contre les agents pathogènes. Procédé infiltration-centrifugation est bien établie en tant que technique robuste pour l'analyse de la composition soluble dans l'apoplaste de diverses espèces végétales. Le fluide obtenu par ce procédé est généralement connu comme apoplaste fluide de lavage (FAE). Le protocole suivant décrit une infiltration sous vide et centrifugation procédé optimisé pour l'extraction de la FAE de Phaseolus vulgaris (haricot français) cv. Tendergreen feuilles. Les limites de cette méthode et l'optimisation du protocole pour d'autres espèces végétales sont discutés. FAE récupéré peut être utilisé dans un large éventail de expéri avalts qui visent à caractériser la composition de la apoplaste et comment il varie en fonction des espèces végétales et le génotype, développement de la plante et les conditions environnementales, ou de déterminer comment les microorganismes se développent dans apoplaste fluide et répondent aux changements dans sa composition.

Introduction

Le apoplaste de la plante est l'espace intercellulaire qui entoure les cellules végétales. Ce est un environnement dynamique dans lequel de nombreux processus métaboliques et de transport ont lieu. Le composant structurel majeur de l'apoplaste est la paroi cellulaire, qui est assemblé et modifié par des enzymes, des protéines structurales et des métabolites situés dans l'apoplaste. Dans les cellules végétales saines l'apoplaste est généralement maintenu dans un état ​​acide permettant acides aminés, des sucres et d'autres nutriments pour être importés de l'apoplaste vers le cytoplasme par H + symport 1. Pendant le transport, le saccharose, le saccharose se déplace à partir de sources photosynthétiques à travers l'apoplaste et dans le système vasculaire du phloème; saccharose est ensuite transporté par un potentiel osmotique à jour par clivage invertases apoplastiques saccharose dans les deux organes puits. Sucres et autres nutriments peuvent également être transportés vers le haut et se accumulent dans des cavités stomatiques à travers le flux de transpiration 3.

"> Le apoplaste représente aussi une niche écologique où de nombreux agents pathogènes établissent leur mode de vie parasitaire. Pathogènes végétaux bactériens ont la capacité de se multiplier à des densités élevées dans l'apoplaste, qu'ils accèdent à travers des ouvertures naturelles telles que les stomates ou par des blessures 4. La concentration de l'aminé aminés et autres composés azotés dans la tomate apoplaste ont été montrés pour être suffisante pour répondre aux besoins nutritionnels des agents pathogènes bactériens et fongiques 5,6. réponses de défense primaire vers pathogènes microbiens se produisent également dans l'apoplaste, à savoir la production d'espèces réactives de l'oxygène par les peroxydases extracellulaires . et oxydases et le renforcement de la paroi cellulaire par réticulation et callose dépôt 7 La paroi cellulaire de la plante est riche en métabolites secondaires ayant des activités anti-microbiennes, la nature biochimique de ces métabolites secondaires varie entre huit espèces.

En raison de la mention ci-dessus,ed et d'autres processus, feuille apoplastique fluide contient une variété de protéines, les sucres, les acides organiques, les acides aminés, les métabolites secondaires, des métaux et d'autres cations (par exemple, Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). Les concentrations de soluté dans l'apoplaste de pousses sont contrôlés en grande partie par l'équilibre des processus de transport qui se produisent entre l'apoplaste et le xylème, phloème et 9 cytoplasme. Cependant, les réactions métaboliques et la croissance microbienne ou consomment également produisent solutés apoplastiques. La composition de la apoplaste est connu pour différer entre les espèces et des génotypes végétaux et en réponse à l'évolution des conditions environnementales, y compris la lumière, de la nutrition et de stress biotiques et abiotiques neuf. En étudiant la composition de l'apoplaste et son évolution, y compris des propriétés telles que redox et le potentiel osmotique, le pH, des nutriments / la disponibilité des métabolites et les activités enzymatiques, on peut obtenir de nouvelles indications sur la façon dont les plantes repondent à leur environnement. Accord ou caractériser les changements moléculaires qui se produisent dans la solution de apoplaste est compliquée car il se agit d'un compartiment spatialement structuré et dynamique dans lequel les métabolites et / ou des ions peuvent être volatils, de passage ou associé à la paroi cellulaire et la membrane plasmique. En outre, différentes techniques d'analyse sont nécessaires pour couvrir la gamme de différents types de produits chimiques.

Pour étudier la composition de l'apoplaste soluble, habituellement liquide doit être extrait à partir du tissu. Plusieurs méthodes existent pour extraire apoplaste fluide à partir de divers tissus, y compris une méthode de bande filtrante nouvellement proposé 10, mais la méthode d'extraction plus établies pour les feuilles est infiltration-centrifugation. Cette technique a été évaluée précédemment 11-13 et Lohaus et al. 2001 14 fournir un examen approfondi de la plupart des paramètres techniques de la méthode. Comme son nom l'indique, l'infiltration-centrifugation technique est un procédé en deux étapes qui implique essentiellement le remplacement de la lame d'air apoplastique avec un fluide d'imprégnation aqueuse qui se mélange avec le fluide apoplastique natif, suivie de la récupération de l'infiltration / apoplastique mélange fluide par centrifugation douce des feuilles. Comme le fluide récupéré est dilué et ne contient pas tous les composés présents dans le apoplaste (voir ci-dessous), ce fluide est communément connu comme apoplaste fluide de lavage (FAE), ou liquide de lavage parfois intercellulaire, plutôt que fluide apoplastique. La technique infiltration-centrifugation est facilement évolutive permettant échantillons individuels ou communs de la FAE de volume suffisant pour être générées et soumises à un large éventail de techniques biochimiques et d'analyse en aval (par exemple, électrophorèse des protéines, mesure de l'activité enzymatique, RMN, de nombreux types de chromatographie et de masse Spectrométrie). Feuille FAE est également utile comme apoplaste imitant milieu de croissance pour l'étude de l'interaction de la plante colonisatrice microbes esprith leur environnement 5.

Dans les protocoles suivants, nous décrivons comment effectuer la technique infiltration-centrifugation en utilisant Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen feuilles, et donner quelques exemples d'analyses en aval avec un accent sur la métabolomique. Fait important, les méthodes pour évaluer la qualité de la FAE sont fournis ainsi que des conseils pour optimiser la procédure de différents types de feuilles.

Protocol

NOTE: Le choix de la matière de départ de la feuille et la normalisation des conditions de croissance des plantes est essentiel que ces facteurs peuvent grandement affecter la qualité, la variabilité et le rendement de la FAE (Figure 1). Les paramètres à prendre en considération sont présentés dans le tableau 1 et sont discutés plus en détail dans la discussion. Paramètre Exemple normalisations Phaseolus vulgaris Solanum lycopersicum Arabidopsis thaliana Type de feuilles Premières vraies feuilles, complètement développée, en bonne santé 2 e et 3 e à partir de feuilles de fond, quatre grandes dépliants prises dépliant apicale ne est pas utilisé pour l'extraction apoplaste Feuilles de la rosette complètement développées âge de la plante 21 jours 7 – 9 semaines </td> 7 semaines Heure de la journée Milieu de période de lumière (12:00) Milieu de période de lumière (12:00) Milieu de période de lumière (12:00) Hydration Toutes les plantes bien arrosées 1 h avant la récolte Toutes les plantes bien arrosées 1 h avant la récolte Toutes les plantes bien arrosées 1 h avant la récolte Lumière La lumière de 16 h, 400 pmol m -2 s -1 La lumière de 16 h, 400 pmol m -2 s -1 10 heures de lumière (à court jours) de la semaine 2, 400 pmol m -2 s -1 Humidité 70% 70% 70% Température 22 ° C la lumière, 18 ° C sombre 22 ° C la lumière, 18 ° C sombre 21 ° C Tableau 1. Exemples de Paramé normaliséeTER pour les feuilles utilisées dans l'extraction de la FAE. 1. Génération apoplaste laver Fluid REMARQUE: Au cours de ce protocole materila dangereux inculding pathogènes microbiens à partir de feuilles infectées ne doit pas être lavée dans le drain; les procédures d'élimination plutôt appropriées doivent être utilisées. Choisissez un appareil basé sur la taille de la feuille: Infiltrez feuilles plus petites (par exemple, Arabidopsis, haricot) en utilisant une seringue sans aiguille. Utilisez une fiole à vide pour infiltrer les feuilles qui sont trop volumineux pour tenir dans une seringue. Utilisez la méthode du flacon de vide d'infiltrer plusieurs feuilles simultanément. Diviser les feuilles qui sont trop grands pour le procédé d'infiltration disponible en sections plus petites en utilisant une lame de rasoir. Sections de feuilles rincer soigneusement découpées dans de l'eau distillée avant l'infiltration pour éliminer les contaminants cytoplasmiques qui respirent par les cellules endommagées. Feuille infiltration aide d'une seringue de 60 ml: Détachez la feuille de lapétiole à la plante en utilisant une lame de rasoir. Pour feuilles composées comme la tomate, détacher de tracts à l'pétiolule. Rincer la feuille fraîchement excisées par immersion dans l'eau distillée pour enlever les contaminants de surface des feuilles. Séchez la feuille en tamponnant délicatement avec un tissu ou un papier absorbant. Mesurer le poids de la feuille avant infiltration. Rouler avec précaution et / ou plier la feuille dans une seringue de 60 ml et remplir la seringue avec de l'eau distillée (autres fluides d'infiltration peuvent être utilisés, voir la discussion). Éjecter l'air dans la seringue tout en abaissant le piston à peu près la marque de 40 ml. Couvrez le bout de la seringue soit avec un doigt ganté ou un morceau de Parafilm, puis créer une pression négative dans la seringue en tirant le piston vers l'extérieur pour la marque de 60 ml. Relâchez doucement le piston. REMARQUE: libérer rapidement la pression peut se traduire par la lyse des cellules et la contamination cytoplasmique. Débranchez l'extrémité de la seringue et éjecter l'air, puis rebrancher la pointe et appuyez surd'autres vers le bas sur le piston pour créer une quantité modeste de pression positive. Répétez les étapes 1.2.5 – 1.2.6 jusqu'à ce que la feuille est entièrement infiltré, comme on le voit par la couleur sombre des zones infiltrées. Retirer la feuille à partir de la seringue. Doucement mais complètement effacer la feuille avec du papier absorbant pour enlever le liquide de surface. Mesurer le poids de la feuille infiltrée. Calculer la différence de poids avant et après infiltration qui se rapproche étroitement du volume d'infiltration. Feuille infiltration par fiole à vide: Détachez la feuille de la plante au pétiole aide d'une lame de rasoir. Rincer la feuille fraîchement excisées par immersion dans l'eau distillée pour enlever les contaminants de surface des feuilles. Séchez la feuille en tamponnant délicatement avec du papier absorbant. Mesurer le poids de la feuille avant infiltration. Placez la feuille (ou laisse se infiltrer plusieurs feuilles) dans un 250 ml ou plus côté bras flacon containing eau distillée (autres fluides d'infiltration peuvent être utilisés, voir Discussion). Couvrir entièrement les feuilles avec le liquide. Appliquer un vide dans le ballon. Agiter doucement afin de libérer les bulles d'air à partir des feuilles. Soigneusement et lentement libérer le vide. REMARQUE: libérer rapidement le vide peut conduire à la lyse des cellules et la contamination cytoplasmique. Répétez l'étape 1.3.5 jusqu'à ce que la feuille est entièrement infiltré, comme on le voit par la couleur sombre des zones infiltrées. Retirer la feuille du ballon. Doucement mais complètement effacer la feuille avec du papier absorbant pour enlever le liquide de surface. Mesurer le poids de la feuille infiltrée. Calculer la différence de poids avant et après infiltration qui se rapproche étroitement du volume d'infiltration. Récupération de la FAE par centrifugation: Placez la feuille sur un morceau de 4 pouces (10 cm) de large Parafilm. En utilisant une pointe de pipette de 5 ml (ou un objet de taille similaire),rouler la feuille dans le Parafilm. Insérez la feuille enroulée avec la pointe de la pipette dans une seringue de 20 ml. Placez tous les bords de la feuille de coupe vers le haut. Insérer la seringue dans 50 ml polyéthylène ou polycarbonate tube propre. Centrifuger la seringue dans le tube pendant 10 min à 1000 x g dans un rotor à godets oscillant à 4 ° C. REMARQUE: examen visuel des feuilles suivantes centrifugation devrait révéler que la majorité du fluide d'infiltration a été expulsé. Taches vertes foncées indiquent que le temps de centrifugation est nécessaire. Pipeter la FAE récupéré dans 1,5 ml de nouveaux tubes. REMARQUE: Le volume de la FAE doit correspondre à environ le volume d'infiltration pour cette feuille; si le volume est inférieur à temps supplémentaire de centrifugation ou de la vitesse de centrifugation est nécessaire. Centrifuger les échantillons à la FAE 15000 xg pendant 5 min pour éliminer les cellules ou les particules. Vous pouvez aussi transmettre la FAE à travers un filtre de 0,22 um à Remove cellules et des matières particulaires. Introduire à la pipette le surnageant dans un nouveau tube. Garder les échantillons sur la glace jusqu'à ce stockage. Stocker les échantillons de la FAE à -80 ° C. 2. Des dosages pour la contamination cytoplasmique Gardez les échantillons de la FAE sur la glace pour minimiser les réactions enzymatiques (par exemple, protéolyse) et effectuer les essais immédiatement après les étapes de centrifugation sont complets. NOTE: Pour les dosages de métabolites, les échantillons peuvent être congelés immédiatement après l'extraction et stockés à -80 ° C jusqu'à utilisation. Pour une malate déshydrogénase standard (MDH) protocole de dosage voir 15; sinon, utilisez un kit de dosage MDH disponible dans le commerce. Pour une glucose-6-phosphate déshydrogénase norme (G6PDH) protocole de dosage voir 16; sinon, utilisez un kit de dosage G6PDH disponible dans le commerce. Pour la quantification des métabolites cytoplasmiques tels que le glucose-6-phosphate (G-6-P) en utilisant GC-MS comme décrit dans l'étape 5 </strong>. Sinon, utilisez un kit disponible dans le commerce pour le dosage direct de G-6-P. 3. Calcul du facteur de dilution apoplaste Préparer deux volumes du fluide d'infiltration utilisée ci-dessus à l'étape 1.2.4 ou 1.3.4 (par exemple, l'eau distillée). Ajouter la poudre de carmin indigo à une solution à une concentration finale de 50 uM, ne ajoutent rien à l'autre. Mesurer l'absorbance à 610 nm (DO 610) de 200 ul de la solution d'infiltration indigo carmin avec un lecteur de plaque. Corriger cette valeur en soustrayant la DO 610 de 200 ul de solution d'infiltration sans indigo carmin. Remplacez cette valeur corrigée comme OD 610infiltrate dans l'équation ci-dessous. Effectuer au moins trois infiltrations répétition des feuilles comme ci-dessus (étape 1.2 ou 1.3) avec les deux solutions d'infiltration (avec et sans carmin d'indigo). Après infiltration, rInse les feuilles dans de l'eau distillée pour enlever tout reste de l'indigo carmin présents sur les surfaces extérieures. Procéder à la centrifugation comme ci-dessus (étape 1.4). Déterminer la DO moyenne de 610 200 pi des extractions de la FAE indigo carmin. Corrigez cette valeur en soustrayant la valeur moyenne OD 610 de 200 pi de l'indigo carmin gratuitement FAE. Remplacez cette valeur corrigée comme OD 610AWF dans l'équation ci-dessous. Calculer le facteur de dilution (ce est à dire, dilutions) à partir des valeurs d'absorbance corrigées que: Apoplaste facteur de dilution = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate – OD 610AWF) Concentration ou l'activité Multiplier les valeurs de la FAE par le facteur de dilution pour estimer la concentration / activité dans le liquide apoplastique in planta. 4. Concentration de la FAE à pleine puissance par lyophilisation Allumez le lyophilisateur et unllow à se stabiliser à la température de travail et la pression. Mutualiser la quantité désirée de la FAE échantillons frais ou stockées. Distribuer les échantillons de façon égale entre deux tubes ml de centrifugeuses. Déterminer le volume de reconstitution: Reconstitution volume = volume avant lyophilisation / apoplaste facteur de dilution Avec les paupières closes, geler les tubes dans l'azote liquide. Transférer les tubes congelés à une ou plusieurs cuves de lyophilisation réfrigérés. Lors du transfert des tubes, remplacer le couvercle avec celui qui a été percé avec un objet pointu pour permettre l'échange de gaz. Fixez les navires au lyophilisateur et lyophiliser les échantillons complètement. Retirer les échantillons de la machine et reconstituer la FAE en ajoutant la quantité calculée d'eau distillée. Remettre le couvercle non percée et stocker les échantillons à -80 ° C. 5. analyse de métabolites par chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse 17 <ol> Pipette 200 pi de la FAE dans un tube de 1,5 ml Ajouter 700 pi de methanol contenant 10 ug / ml de ribitol comme étalon interne. On chauffe à 70 ° C pendant 10 min. Centrifugeuse pendant 10 min à 11 000 x g. Transférer 700 pl de surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Ajouter 375 ul de chloroforme froid et vortex pendant 10 sec. Ajouter 500 ul de dH 2 O et vortex pendant 10 s. Centrifugeuse pendant 15 min à 2200 x g. Transférer 150 ul de la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube de 1,5 ml, puis sécher les échantillons complètement dans un concentrateur sous vide sans chaleur. Dissoudre les échantillons dans 30 pl de pyridine contenant 20 mg / ml de chlorhydrate de méthoxyamine. Incuber à 70 ° C tout en agitant vigoureusement pendant 2 h. Ajouter 50 ul de MSTFA (N-méthyl-N- (triméthylsilyl) trifluoroacétamide). Incuber à 37 ° C tout en agitant pendant 30 min. échantillons de transfert GC-MS compdes flacons en verre atible. Effectuer l'analyse des échantillons GC-MS. Reportez-vous à Lisec et al. 2009 17, pour plus de détails sur la configuration de l'équipement GC-MS et de la performance.

Representative Results

Les résultats typiques pour les extractions de la FAE effectuées sur la saine vieille trois semaines P. vulgaris cv. Tendergreen feuilles, en utilisant de l'eau distillée comme liquide d'infiltration sont présentés dans le tableau 2. Jeune P. vulgaris feuilles se prêtent à l'infiltration, et à la vitesse de centrifugation utilisé ici (1000 xg) l'élimination de la majorité du liquide d'infiltration par centrifugation peut être vu directement que les feuilles reviennent à leur couleur verte d'origine. P. vulgaris feuilles poids frais était en moyenne de 1,1 xg avant infiltration et a donné 0,5 ml de la FAE par gramme de poids frais. La concentration en protéines de la FAE a été déterminée comme étant de 0,18 ± 0,08 mg / ml en utilisant un essai standard de protéine de Bradford. Le facteur de dilution pour ces feuilles, calculée en mesurant le carmin d'indigo dilution, était de 2,3 ± 0,3 fois. Les valeurs ci-dessus peuvent varier considérablement entre les espèces et des expériences pilotes sont requis pour déterminer le rendement de la FAE par gramme feuilles fraîches nousroite, ainsi que la concentration en protéine FAE et le facteur de dilution qui peut être attendue pour un type de feuille donnée. Atteinte à l'intégrité des cellules peut se produire à la fois pendant l'étape d'infiltration, si les variations de pression trop rapide, et au cours de l'étape de centrifugation, si la force centrifuge est trop élevée. Il est donc nécessaire de doser des échantillons de la FAE pour les marqueurs de contamination cytoplasmique; idéalement, plusieurs essais indépendants sont effectuées. Ici, les résultats de trois essais possibles sont présentés au tableau 2. Dans bien des extractions réalisées de P. vulgaris FAE, G6PDH était indétectable par un dosage de l'enzyme standard. Ceci est cohérent avec d'autres rapports où l'activité de la G6PDH devient détectable qu'au dessus d'un seuil de force centrifuge 12. En revanche, un niveau d'activité de malate déshydrogénase (2,5 U / ml) ligne de base était détectable dans toutes P. échantillons vulgaris FAE en utilisant un dosage métabolique standard. L'augmentation de la centrifuge pourCE-dessus d'un seuil de 1 000 xg a donné lieu à une augmentation des activités MDH (résultats non montrés). Comme l'apoplaste d'autres espèces est connu pour contenir l'activité de 18 MDH endogène, la quantité détectée ici est considéré comme une véritable activité apoplastique et des augmentations significatives dessus de ce niveau de référence sont un signe de contamination. Métabolites qui sont pensés pour être principalement cytoplasmique, comme hexose-6-phosphates, peuvent également être utilisés pour évaluer la contamination de la FAE. Ici, l'analyse par GC-MS détecté zéro ou traces niveaux de G-6-P dans les extractions de la FAE. En revanche, dans les sections de racines de maïs coupé, G-6-P a été détecté après l'extraction de la FAE à toutes les vitesses de centrifugation et l'augmentation de la concentration à des vitesses plus élevées, ce qui indique une contamination cytoplasmique 10. l'analyse des métabolites par GC-MS de P. vulgaris feuilles FAE donne généralement de 40 à 60 métabolites identifiables et un nombre approximativement égal de composés non identifiables (Figure 2). Ouacides ganiques, sucres simples, et les acides aminés représentent la majeure partie des métabolites identifiables, cependant, métabolites secondaires des plantes ont également été détectés et quantifiés à partir de 11 FAE. Plusieurs pics exemple de ces différentes classes de molécules sont marqués dans la figure 2 autres techniques d'analyse en aval sont applicables à ces échantillons de la FAE pour quantifier diverses molécules, par exemple:. ICP-MS, RMN, HPLC, spectroscopie d'absorption atomique, spectrométrie de masse de protéines. Le composant protéique de l'apoplaste est également représentée dans la FAE comme indiqué dans le gel coloré SDS-PAGE au bleu de Coomassie Brilliant Blue sur la figure 3. Parmi d'autres fonctions, les enzymes apoplastiques sont responsables de la synthèse de la paroi cellulaire et la création d'extra-cellulaire réactif des espèces d'oxygène. Études protéomiques de la FAE de diverses espèces ont identifié des dizaines de protéines individuelles et montré que le composant protéique de la apoplaste répond à Envirole stress nnement 13,19. Idéalement extrait de la FAE devrait être libre de toute contamination par des protéines cytoplasmiques tels que Rubisco; Cependant, dans la pratique cela est difficile à réaliser. La présence d'une bande de protéine Rubisco à ~ 53 kDa suivante SDS-PAGE fournit une nouvelle analyse qualitative de l'intégrité des échantillons de la FAE. Par exemple, l'échantillon chargé dans la piste 2 sur la figure 3 contient une plus grande quantité de contamination de la Rubisco que une voie. Phaseolus vulgaris FAE Volume de la FAE (g ml -1 FW feuilles) 0,49 ± 0,09 Protein conc. (Mg ml -1) 0,18 ± 0,08 Facteur de dilution 2,3 ± 0,3 l'activité de la G6PDH (U ml -1) <td> Aucune détecté Glc-6-P (mg ml -1) aucun détecté Activité MDH (U ml -1) 2,5 ± 0,9 Tableau 2. Les résultats typiques pour les extractions de la FAE P. vulgaris cv. Tendergreen feuilles. Figure 1. Norme extraction de apoplaste workflow. Les numéros renvoient aux étapes du protocole. Figure 2. Un exemple Chromatogramme GC-MS de P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF Les pics numérotés de métabolites exemple sont les suivants: 1-malonate, le 2-phosphate, succinate-3, 4-inconnu, 5-malate, le 6-asparagine, la 7-ribitol (st interneandard), 8-citrate, 9-glucose, 10-inositol, l'acide caféique-11, 12-saccharose. Figure 3. Un exemple SDS-PAGE coloré au Coomassie du gel de P. Vulgaris extraits de feuilles FAE. Ce gel présente une comparaison entre les composants protéiques de deux extractions FAE qui diffèrent par la quantité de contamination par l'enzyme cytoplasmique plastidial abondante Rubisco. Après extraction de la FAE deux échantillons ont été soumis à la protéine de précipitation à l'acétone dans un excès d'un facteur 4 (v / v) d'acétone froid et resolubilisés dans l'eau à un dixième du volume d'origine. Les pistes 1 et 2 contiennent 40 ug de protéine. La bande correspondant à la grande chaîne Rubisco (~ 53 kDa) est indiquée par une flèche. M r: protéines marqueurs de poids moléculaire.

Discussion

Optimisation de la source de tissu végétal

La variation biologique et technique peut être important lors de l'exécution apoplaste extractions, donc un flux de travail hautement normalisé est utile d'augmenter la continuité à travers des expériences (Figure 1). Fait important, la source de tissu végétal doit être étalonnée, y compris le type de la feuille, l'âge de la feuille, / conditions d'environnement de croissance et de l'heure du jour (tableau 1). De grandes différences existent dans la facilité avec laquelle les différentes feuilles sont infiltrés et la FAE ensuite récupérées par centrifugation; ces différences sont en corrélation avec le nombre de stomates, taille de l'ouverture et de la résistance mésophylle 12,14. Même parmi les différents cultivars de P. vulgaris il ya de grandes différences dans la facilité et le rendement de la procédure d'extraction de la FAE; par exemple les feuilles de la variété Tendergreen utilisée ici se prêtent davantage à l'extraction de la FAE en utilisant cette méthode que le cultivar de Wonder canadienne. DansP. vulgaris les premières vraies feuilles sont le plus grand et le plus facile à infiltrer, ce qui en fait le choix évident pour les extractions apoplastiques. Le volume de l'air et de l'eau apoplastique a été montré à varier avec l'âge des feuilles chez plusieurs espèces conduisant à des différences dans la FAE extractibilité 12,14. Dans P. vulgaris, vieilles feuilles deviennent beaucoup plus difficiles à infiltrer et de produire moins de la FAE lors de la centrifugation; donc feuilles ont été récoltés quand ils ont atteint pleine expansion. Les feuilles qui sont difficiles à infiltrer nécessitent des vitesses de centrifugation plus élevés pour récupérer la FAE suite. Il faut donc dépister attentivement plusieurs types de feuilles différentes et variétés avant de décider d'une source de tissu pour les extractions de la FAE à grande échelle.

conditions de croissance des plantes doivent également être normalisés autant que possible dans le contexte de l'expérience. L'utilisation d'armoires de croissance est préférable car ils permettent l'humidité constante, la température et lighrégiments t intensité pour être maintenues. La récolte des feuilles doit toujours se produire au même moment de la journée parce que les concentrations de métabolites, des enzymes, etc. varient tout au long du cycle diurne 14. Enfin, pour se assurer que l'usine laisse tous ont la pression de turgescence similaire, les plantes doivent être arrosées dès avant (~ 1 h) la récolte.

Optimisation de l'infiltration et de centrifugation à lame

Cytoplasmique contamination indésirable de la FAE due à la lyse de la cellule partielle en résultera si les contraintes mécaniques rencontrées par les cellules est trop élevée au cours des étapes de centrifugation ou infiltration. Par conséquent, la procédure pour un type de feuille donnée devrait être un compromis optimisé entre la maximisation de rendement et minimiser la contamination cytoplasmique de la FAE. Dans tous les cas, il faut utiliser la plus basse vitesse de centrifugation à laquelle la FAE peut être récupéré afin d'éviter toute rupture mécanique des cellules de la feuille. Optimisation de la centrifugation de vitesse doit être déterminée de manière empirique pour chaque type de feuille en surveillant le volume récupéré et apoplaste contamination sur une plage de vitesses de centrifugation. Il a été observé que les activités enzymatiques marqueurs, tels que MDH, G6PDH et le glucose-phosphate isomérase, reste faible jusqu'à ce qu'une force centrifuge de seuil est dépassé, au-dessus duquel ces activités augmentent rapidement, probablement en raison de fuites cytoplasmique 9,12,14. L'utilisation de Parafilm pour le soutien lors de l'étape de centrifugation, comme indiqué par Baker et al. 2012 11, peut améliorer l'efficacité de l'extraction de la FAE et peut minimiser les dommages mécaniques à la lame de feuilles causé par pliage excessif et compression. En outre, l'utilisation de Parafilm améliore la visualisation de la feuille après centrifugation quand il convient d'examiner la feuille pour les dommages et l'exhaustivité de l'extraction de la FAE.

Nouchi 12 décrire l'optimisation de la récupération de la FAE de sections de feuilles de riz de coupe, qui sont difficult pour infiltrer et nécessitent des vitesses de centrifugation élevée, pour recueillir la FAE en raison de leurs petites ouvertures stomates. L'amélioration de mouillage de la surface des feuilles de riz, soit par pré-trempage des feuilles dans de l'eau distillée ou de l'addition d'un tensioactif au liquide d'infiltration, facilité le processus d'infiltration. Une vitesse de centrifugation plus élevé (6000 xg) a également été utilisé lors de contrôle de la contamination apoplastique 12. Lors de l'utilisation des sections de feuilles de coupe, il ya toujours le risque que la contamination cytoplasmique sera plus répandue, même avec un lavage poussé des sites de la plaie; feuilles coupées ne devraient donc être utilisés lorsque cela est nécessaire.

Pour beaucoup d'études de l'eau distillée est utilisée comme fluide de 11 l'infiltration. Cependant, les composés peuvent être ajoutés au fluide d'infiltration, tels que des sels ou des tampons, pour améliorer l'extraction de certains composés, en particulier les protéines apoplastiques 13. Lohaus 14 a évalué l'effet de la force ionique et osmotique on la composition de la FAE récupéré et les a jugées négligeables. Les variations de pH du milieu d'infiltration, cependant, peuvent affecter la composition de la FAE 14.

Manipulation et le stockage du fluide apoplastique extrait est important. FAE a été montré pour contenir une multitude de proteases et d'autres enzymes 13,20, ainsi que des composés organiques volatils. Par conséquent, pour réduire les changements à la composition de la FAE après la récupération il est recommandé de conserver des échantillons sur la glace ou autrement stockées à -80 ° C. En outre, dosages enzymatiques de la FAE doivent être effectuées dès que possible après l'extraction de limiter l'inactivation enzymatique due à la protéolyse, la dilution prolongée ou de gel-dégel.

Le processus d'infiltration dilue le fluide apoplastique et il est souvent nécessaire de déterminer l'étendue de cette dilution. L'étape de centrifugation peut aussi diluer la FAE avec de l'eau à partir des compartiments intracellulaires. Un facteur de dilution est nécessaireed pour estimer in vivo apoplaste concentrations en produits chimiques lors de mesures sont effectuées sur la FAE. Un facteur de dilution est également nécessaire de se concentrer FAE à nouveau au complet quand il est utilisé comme un apoplaste imitant milieu de croissance pour les microbes – correspondant donc à des concentrations de métabolites in vivo aussi précisément que possible. Plusieurs variantes existent sur ​​la méthode décrite dans l'étape 4 pour déterminer le facteur de dilution FAE en mesurant la dilution d'un composé ajouté au fluide d'infiltration du marqueur. Pour toutes les méthodes de calcul de dilution FAE suppose que le fluide d'infiltration est pas sensiblement absorbée ou dilué par les cellules de la feuille pendant le processus de récupération FAE. Cette hypothèse a été vérifiée précédemment pour l'étape d'infiltration, mais 14 ne est pas vérifiée pour l'étape de centrifugation. Le composé marqueur doit également pas être absorbé, transporté ou tout modifié dans le apoplaste. Indigo carmin est le plus largement utilisé et soigneusement testé de colorants utiliséspour la FAE calculs de dilution. Carmin d'indigo affiche une faible absorbance à la résine échangeuse de cations et des parois cellulaires isolés et se est révélé être approprié pour le calcul de la FAE dans Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum et Glycine max 11,21,22. Toutefois, dans certains types de feuilles, par exemple, le riz et le concombre, l'indigo carmin semblait ne pas être entièrement récupéré après l'infiltration, ce qui conduirait à une sous-estimation du facteur de dilution FAE 12,21. L'absence de récupération de l'indigo carmin est peut-être en raison de sa susceptibilité au clivage par l'isatine en sulfonate 23 dismutase, qui est connue pour être produite dans l'apoplaste, en particulier 24 sous contrainte. Le clivage du carmin d'indigo dans sulfonate isatine se traduira par une perte d'absorbance à 610 nm et une augmentation à 245 nm. Que cette réaction se produit dans une mesure appréciable dans l'apoplaste, ou si cette réaction peut être inhibée par l'addition d'accepteurs d'infiltrat à dismutasesfluide ionique n'a pas été étudiée à ce jour. Bleu Dextrane a été utilisé à la place de l'indigo carmin, pour la quantification du facteur de dilution du riz FAE feuilles 12, bien que sa stabilité et sa récupération dans la FAE n'a pas été signalée. En variante, les composés radio-marqués tels que [14 C] sorbitol ou d'autres normes et quantifiables internes peuvent être utilisés à la place de colorants et de la diminution de la radioactivité ou de la concentration mesurée et utilisée pour calculer le facteur de dilution d'une manière analogue 11,14,25.

Limites de la technique

Quelques mises en garde existent pour la méthode d'isolement de la FAE infiltration-centrifugation. Tout d'abord, la dilution de l'apoplaste au cours de l'infiltration peut obtenir une réponse de la plante. Si les cellules des feuilles environnantes détectent une concentration diminuée pour certains composants du fluide apoplastique, ils peuvent réagir en excréter autres métabolites, faussent l'interprétation des concentrations de métabolites. Enune évaluation de ce problème, il a été observé que ni le temps entre infiltration et centrifugation ni différences modérées de la force ionique du fluide d'infiltration affecté la composition de l'extrait FAE 14,22. Par conséquent, tous les artefacts résultant de la dilution apoplaste sont considérés comme minimes.

Un deuxième inconvénient potentiel est que l'élution de la FAE par centrifugation ne tient pas compte de toutes les molécules présentes dans l'apoplaste pour plusieurs raisons. Certains composés, en particulier les cations et les protéines peuvent être étroitement associés à la paroi cellulaire chargée négativement et ne se éluent avec le FAE 13. D'autres molécules telles que les protéines peuvent être trop grandes pour éluer de manière efficace hors de l'apoplaste aux vitesses de centrifugation 14 utilisés. Espèces réactives de l'oxygène sont une classe importante de composé produit dans l'apoplaste, mais en raison de la nature éphémère de ces composés, et les exigences non précisées pour leur production, leur presence ne est pas bien capturé par extraction de la FAE. On ne sait pas exactement comment la FAE représente la composition in vivo du fluide de apoplaste et cela peut varier entre les espèces.

Plusieurs tests existent pour déterminer la contamination cytoplasmique, mais aucune ne est universellement acceptée. Les dosages d'enzymes cytoplasmiques principalement (par exemple, G6PDH, phosphate isomérase hexose, MDH) ont l'avantage d'être facile à réaliser, mais peut ne pas corréler bien avec fuites cytoplasmique 14,18. L'évaluation des métabolites cytoplasmiques (par exemple, les phosphates de hexose, chlorophylle) est peut-être plus indicatif, mais est moins bien établie 11. Néanmoins, les deux types de test peut être utile pour la quantification relative de la contamination entre les échantillons apoplastique. Idéalement, plusieurs mesures indépendantes devraient être utilisés pour valider l'intégrité de l'échantillon de la FAE.

Tout en reconnaissant ses limites, l'infiltration-centrifugatisur la technique décrite ici reste une technique simple et robuste dans l'étude des protéines, métabolites apoplastiques primaires et secondaires et des ions inorganiques.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Eppendorf Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22364111
razor blade Fisher 12-640 
60 ml syringe Becton Dickinson 300865
20 ml syringe Becton Dickinson 300613
4 inch parafilm Bemis PM-996
side arm flask SciLabware 12972831
vacuum source
5 ml pipette tips Fisher 50-813-28 
centrifuge Beckman Coulter 392932
Swinging bucket rotor Beckman Coulter 369702
indigo carmine Sigma I8130
microplate reader Tecan Infinite 200
96 well plates Becton Dickinson 353072
freeze dryer SciQuip Christ Alpha 2-4 LD
microcentrifuge biorad 166-0612EDU
oxaloacetic acid Sigma O4126
D-glucose-6-phosphate Sigma G7250
NADH Roche 10128023001
MDH assay kit Biovision K654-100
G6PDH assay kit Sigma MAK015-1KT
G-6-P assay kit Biovision K657-100
ribitol Sigma A5502
methanol Sigma 650471
chloroform Sigma 472476
vacuum concentrator Thermor Scientific SC250EXP
methoxyamine hydrochloride Sigma 226904
N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide Sigma 394866
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References

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O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example. J. Vis. Exp. (94), e52113, doi:10.3791/52113 (2014).
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