تقنية تسلل الطرد المركزي لاستخراج Apoplastic السوائل من أوراق النبات عن طريق<em> فاصيلوس الشائع</em> كمثال
Summary
This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.
Abstract
في الممر الخلوي الغشائي هو حجرة خارج الخلية متميزة في الأنسجة النباتية التي تقع خارج غشاء البلازما ويتضمن جدار الخلية. مقصورة apoplastic من أوراق النبات هو موقع العديد من العمليات البيولوجية الهامة، بما في ذلك تشكيل جدار الخلية، والمغذيات الخلوية وامتصاص الماء والتصدير، والتفاعلات محطة نابوت داخلي والاستجابات الدفاع لمسببات الأمراض. وراسخة طريقة تسلل الطرد المركزي كأسلوب قوية لتحليل تركيبة الممر الخلوي الغشائي للذوبان من الأنواع النباتية المختلفة. السائل التي حصلت عليها هذه الطريقة هو المعروف باسم الممر الخلوي الغشائي سائل الغسيل (AWF). يصف بروتوكول بعد تسلل الفراغ والطرد المركزي الطريقة الأمثل لAWF الاستخراج من فاصيلوس الشائع (الفول الفرنسي) السيرة الذاتية. Tendergreen الأوراق. وتناقش القيود المفروضة على هذه الطريقة وتعظيم الاستفادة من بروتوكول للأنواع النباتية الأخرى. المستردة AWF يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التجربه المصبTS التي تسعى لتوصيف تركيبة الممر الخلوي الغشائي وكيف أنه يختلف ردا على الأنواع النباتية وراثى والتنمية النباتية والظروف البيئية، أو لتحديد كيفية نمو الكائنات الحية الدقيقة في الممر الخلوي الغشائي السوائل والاستجابة للتغيرات في تكوينها.
Introduction
في الممر الخلوي الغشائي المصنع هو الفضاء بين الخلايا التي تحيط الخلايا النباتية. هذا هو بيئة ديناميكية فيه العديد من عمليات الأيض والنقل تحدث. العنصر الهيكلي الرئيسي للالممر الخلوي الغشائي هو جدار الخلية، والتي يتم تجميعها وتعديلها من قبل الإنزيمات والبروتينات الهيكلية ونواتج الأيض التي تقع داخل الممر الخلوي الغشائي. في الخلايا النباتية صحية يتم الحفاظ على الممر الخلوي الغشائي عموما في حالة حمضية مما يسمح الأحماض الأمينية والسكريات والمواد المغذية الأخرى التي سيتم استيرادها من الممر الخلوي الغشائي إلى السيتوبلازم التي كتبها H + symport 1. أثناء النقل السكروز، والتحركات السكروز من مصادر الضوئي من خلال الممر الخلوي الغشائي والأوعية الدموية في اللحاء. ثم يتم نقل السكروز قبل إمكانية التناضحي التي تحتفظ بها invertases apoplastic الشق السكروز في أجهزة الحوض 2. ويمكن أيضا نقل السكريات والمواد المغذية الأخرى صعودا وتتراكم في تجاويف فوهي من خلال مجرى النتح 3.
"> والممر الخلوي الغشائي أيضا يمثل مكانة البيئية حيث تضع العديد من مسببات الأمراض الطفيلية نمط حياتهم. مسببات الأمراض النباتية البكتيرية لديها القدرة على مضاعفة لكثافة عالية في الممر الخلوي الغشائي، وهو ما الوصول إليها من خلال الفتحات الطبيعية مثل الثغور أو من خلال الجروح 4. إن تركيز الأمينية الأحماض والمركبات الآزوتية الأخرى في الطماطم الممر الخلوي الغشائي وقد ثبت أن تكون كافية لدعم الاحتياجات الغذائية من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية 5،6. الردود الدفاع الأولية نحو مسببات الأمراض الميكروبية كما يحدث في الممر الخلوي الغشائي، وهو إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التي بيروكسيديزات خارج الخلية . وoxidases وتعزيز جدار الخلية من خلال عبر ربط وcallose ترسب 7 جدار الخلية النباتية غنية في المركبات الثانوية مع الأنشطة المضادة للميكروبات، والطبيعة الكيميائية الحيوية لهذه المركبات الثانوية تختلف بين الأنواع 8.ونتيجة للذكر أعلاهالضعف الجنسي وغيرها من العمليات، ورقة السائل apoplastic يحتوي على مجموعة متنوعة من البروتينات والسكريات والأحماض العضوية والأحماض الأمينية والمركبات الثانوية، والمعادن والكاتيونات الأخرى (على سبيل المثال، والمغنيسيوم 2+، K +، الصوديوم، الكالسيوم 2+، الحديد 2/3 +). يتم التحكم تركيزات المذاب في الممر الخلوي الغشائي من يطلق النار إلى حد كبير على توازن عمليات النقل التي تحدث بين الممر الخلوي الغشائي والخشب، اللحاء والسيتوبلازم 9. ومع ذلك، التفاعلات الأيضية والنمو الميكروبي أيضا تستهلك أو تنتج المواد المذابة apoplastic. ومن المعروف أن تكوين الممر الخلوي الغشائي أن تختلف بين الأنواع النباتية والأنماط الجينية واستجابة لتغير الظروف البيئية بما في ذلك الضوء والتغذية والحيوية وغير الحيوية الضغوط 9. من خلال دراسة تكوين الممر الخلوي الغشائي وكيف يتغير، بما في ذلك خصائص مثل الأكسدة وإمكانات التناضحي، ودرجة الحموضة، المواد الغذائية / توافر الأيض والأنشطة الإنزيمية، يمكن للمرء الحصول على رؤى جديدة في كيفية إعادة النباتاتبشر تستجيب لبيئتها. فهم أو وصف التغيرات الجزيئية التي تحدث في حل الممر الخلوي الغشائي معقد لأنه حجرة منظم مكانيا والديناميكية التي الأيض و / أو أيونات قد تكون متقلبة، عابرة أو يرتبط مع جدار الخلية وغشاء البلازما. وعلاوة على ذلك، يطلب من التقنيات التحليلية المختلفة لتغطية واسعة من أنواع كيميائية مختلفة.
لدراسة تكوين الممر الخلوي الغشائي للذوبان، والسوائل يحتاج عادة إلى استخلاصها من الأنسجة. وتوجد عدة طرق لاستخراج الممر الخلوي الغشائي السوائل من الأنسجة المختلفة، بما في ذلك أسلوب شريط مرشح المقترحة حديثا 10، ولكن طريقة استخراج الأكثر رسوخا للأوراق هو تسلل الطرد المركزي. وقد تم تقييم هذه التقنية سابقا 11-13 وLohaus وآخرون 2001 14 توفير فحص شامل للعديد من المعايير الفنية طريقة ل. كما يدل الاسم، تسلل-centrifuتقنية gation هي طريقة من خطوتين التي ينطوي أساسا استبدال المجال الجوي apoplastic مع السائل تسلل مائي، والتي تختلط مع السائل apoplastic الأصلي، يليه انتعاش تسلل / apoplastic خليط السائل بواسطة الطرد المركزي لطيف من الأوراق. كما تضعف السائل تعافى ولا يحتوي على كافة المركبات الموجودة في الممر الخلوي الغشائي (أنظر أدناه)، وهذا السائل هو المعروف باسم الممر الخلوي الغشائي سائل الغسيل (AWF)، أو بين الخلايا أحيانا السائل غسل، بدلا من السائل apoplastic. تقنية تسلل الطرد المركزي هي قابلة للتطوير بسهولة تسمح عينات AWF واحدة أو مجمعة من حجم كاف لتوليد وتعرض لمجموعة واسعة من التقنيات الحيوية والتحليلية المصب (على سبيل المثال، الكهربي البروتين، وقياس نشاط انزيم، NMR، العديد من أنواع اللوني والكتلة الطيف). ورقة AWF مفيد أيضا باعتباره الممر الخلوي الغشائي محاكاة النمو المتوسطة لدراسة التفاعل بين النباتات استعمار الميكروبات الطرافةح بيئتهم 5.
في البروتوكولات التالية وصفنا كيفية تنفيذ تقنية تسلل الطرد المركزي باستخدام فاصيلوس الشائع السيرة الذاتية. Tendergreen الأوراق، وتقديم بعض الأمثلة من التحليلات المصب مع التركيز على الايض. الأهم من ذلك، أساليب لتقييم وتقدم نوعية AWF جنبا إلى جنب مع تقديم المشورة لتحسين الإجراء لأنواع أوراق مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الاستفادة المثلى من مصدر الأنسجة النباتية
الاختلاف البيولوجي والتقني يمكن أن تكون كبيرة عند تنفيذ الممر الخلوي الغشائي الاستخراج، وبالتالي سير عمل موحد للغاية مفيد لزيادة الاستمرارية عبر التجارب (الشكل 1). الأهم من ذلك، مصدر الأنسجة النباتية يجب أن تكون موحدة، بما في ذلك نوع ورقة، ورقة السن، والنمو / الظروف البيئية والوقت من اليوم (الجدول 1). وتوجد اختلافات كبيرة في السهولة التي يتم تسلل أوراق مختلفة واستعاد AWF في وقت لاحق عن طريق الطرد المركزي. ترتبط هذه الاختلافات مع عدد الثغور، وحجم الفتحة والمقاومة ورقة 12،14. حتى بين أصناف مختلفة من P. الشائع هناك اختلافات كبيرة في سهولة والعائد من الإجراء استخراج AWF. على سبيل المثال أوراق متنوعة Tendergreen المستخدمة هنا هي أكثر قابلية لاستخراج AWF استخدام هذا الأسلوب من الصنف عجب الكندي. ضمنP. الشائع أول الأوراق الحقيقية هي أكبر وأسهل التسلل، مما يجعلها الخيار الواضح لإخراج apoplastic. وقد تبين الهواء والماء حجم apoplastic أن تختلف مع تقدم العمر ورقة في العديد من الأنواع مما يؤدي إلى اختلافات في AWF الاستخلاصية 12،14. في P. الشائع والأوراق القديمة أصبحت إلى حد كبير أكثر صعوبة للتسلل وتسفر أقل AWF على الطرد المركزي. لذا كانت تحصد أوراق عندما وصلوا التوسع الكامل. أوراق التي يصعب التسلل لاحقا تتطلب سرعات أعلى الطرد المركزي لاسترداد AWF. لذا ينبغي للمرء أن الشاشة بعناية عدة أنواع أوراق مختلفة وأصناف قبل البت مصدر الأنسجة لإخراج AWF نطاق واسع.
يجب أيضا الظروف نمو النبات تكون موحدة قدر الإمكان في سياق التجربة. استخدام خزانات النمو هو الأفضل لأنها تسمح الرطوبة ثابتة ودرجة الحرارة ومن lighأفواج ر كثافة ليتم المحافظة عليها. حصاد الأوراق يجب أن يحدث دائما في نفس الوقت من اليوم لأن تركيزات الأيض، والإنزيمات، الخ تختلف في جميع أنحاء دورة نهاري 14. وأخيرا، لضمان أن أوراق النبات جميعا ضغط الامتلاء مماثل، يجب أن تسقى النباتات قريبا من قبل (~ 1 ساعة) الحصاد.
تعظيم الاستفادة من تسلل ورقة والطرد المركزي
سوف تلوث هيولي غير مرغوب فيه من AWF بسبب تحلل الخلية الجزئي يؤدي إذا كان الضغط الميكانيكي من قبل خلايا اجه مرتفع جدا خلال تسلل أو الطرد المركزي الخطوات. ولذلك، ينبغي أن يكون الإجراء لنوع ورقة تعطى الأمثل مفاضلة بين تعظيم العائد وتقليل التلوث حشوية من AWF. في جميع الحالات، ينبغي للمرء أن استخدام أقل سرعة الطرد المركزي التي AWF يمكن استردادها لتجنب تعطل ميكانيكي ممكن من خلايا ورقة. تعظيم الاستفادة من centrifuوينبغي تحديد سرعة gation تجريبيا لكل نوع ورقة من خلال رصد حجم تعافى والممر الخلوي الغشائي التلوث على نطاق السرعات الطرد المركزي. وقد لوحظ أن الأنشطة انزيم علامة، مثل مليون درهم، G6PDH ومصاوغة الجلوكوز فوسفات، تظل منخفضة حتى يتم تجاوز عتبة قوة الطرد المركزي، أعلاه والتي تزيد من هذه الأنشطة بشكل سريع، ويفترض بسبب تسرب حشوية 9،12،14. استخدام بارافيلم للحصول على الدعم خلال خطوة الطرد المركزي، كما لاحظ بيكر وآخرون 2012 11، ويمكن تحسين كفاءة الاستخراج AWF وربما تقليل الأضرار الميكانيكية إلى ورقة شفرة الناجمة عن لطي المفرط والضغط. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام بارافيلم يحسن التصور من ورقة بعد الطرد المركزي عند ينبغي للمرء أن دراسة ورقة عن الضرر واكتمال استخراج AWF.
Nouchi 12 وصف تعظيم الاستفادة من الانتعاش AWF من أقسام ورقة الأرز قطع، والتي هي دifficult التسلل وتتطلب سرعات أعلى الطرد المركزي لجمع AWF بسبب فتحات الثغور الصغيرة الخاصة بهم. تحسن ترطيب سطح ورقة الأرز، إما عن طريق PRESOAKING الأوراق في الماء المقطر أو إضافة السطحي إلى السائل تسلل، سهلت عملية تسلل. وأعلى سرعة الطرد المركزي (6،000 x ج) كان يستخدم أيضا في حين رصد تلوث apoplastic 12. عند استخدام أقسام قطع ورقة هناك دائما خطر أن التلوث حشوية سيكون أكثر انتشارا حتى مع الغسيل واسعة من المواقع الجرح. ولذلك ينبغي أن تستخدم قطع الأوراق عند الضرورة فقط.
بالنسبة للعديد من الدراسات ويستخدم الماء المقطر كما السائل تسلل 11. ومع ذلك، يمكن إضافة مركبات إلى السائل تسلل، مثل الأملاح أو مخازن، من أجل تحسين استخلاص مركبات apoplastic معينة، وخاصة البروتينات 13. Lohaus 14 تقييم تأثير القوة الأيونية والتناضحي سن تكوين AWF تعافى وجدت لها أن تكون ضئيلة. التغيرات في الرقم الهيدروجيني للتسلل المتوسطة، ومع ذلك، قد تؤثر على تكوين AWF 14.
التعامل السليم وتخزين السائل المستخرج apoplastic هو المهم. وقد تبين AWF لاحتواء وفرة من البروتياز والإنزيمات الأخرى 13،20، وكذلك المركبات العضوية المتطايرة. لذلك، للحد من تغييرات على تركيبة AWF بعد الشفاء من المستحسن الاحتفاظ بعينات على الجليد أو تخزينها على خلاف ذلك في -80 ° C. وعلاوة على ذلك، ينبغي إجراء فحوصات الأنزيمية من AWF في أقرب وقت ممكن بعد استخراج للحد من تعطيل انزيم بسبب التحلل البروتيني، تخفيف لفترات طويلة أو تجميد لاذابة.
عملية تسلل يخفف السائل apoplastic وغالبا ما يكون من الضروري تحديد مدى هذا التخفيف. يجوز للخطوة الطرد المركزي أيضا يخفف من AWF مع المياه من المقصورات داخل الخلايا. وتحتاج عامل التخفيفإد تقدير في الجسم الحي التركيزات الكيميائية الممر الخلوي الغشائي عند إجراء القياسات على AWF. وهناك حاجة إلى عامل التخفيف أيضا على التركيز AWF إلى كامل قوتها عندما يتم استخدامها باعتبارها الممر الخلوي الغشائي محاكاة النمو المتوسطة للميكروبات – وبالتالي مطابقة في تركيزات المستقلب الجسم الحي بأكبر قدر ممكن. وتوجد العديد من الاختلافات في الطريقة الموضحة في الخطوة 4 لتحديد عامل التخفيف AWF عن طريق قياس التخفيف من مركب علامة تضاف إلى السائل التسلل. لجميع وسائل يفترض حساب التخفيف AWF أن السائل تسلل لا يمتص بشكل ملحوظ أو تخفيفه من قبل خلايا ورقة أثناء عملية الاسترداد AWF. هذا الافتراض تم التحقق سابقا للخطوة تسلل 14 ولكن غير مؤكدة للخطوة الطرد المركزي. أيضا يجب أن لا يتم امتصاص المركب علامة، نقل أو تعديل في حين أنه في الممر الخلوي الغشائي. هو يستخدم على نطاق واسع نيلي اللون القرمزي واختبارها بدقة من الأصباغ المستخدمةلإجراء العمليات الحسابية تخفيف AWF. يعرض نيلي اللون القرمزي على الامتصاصية منخفض لراتنج تبادل الأيونات الموجبة وجدران الخلايا المعزولة وأظهرت لتكون مناسبة لإجراء العمليات الحسابية AWF في الكرنب napus، Pisum بيسوم، مغد قوطة وماكس جليكاين 11،21،22. ومع ذلك، في بعض أنواع نبات، على سبيل المثال، والأرز، والخيار، والنيلي اللون القرمزي يبدو لا يمكن استردادها بالكامل بعد تسلل، التي من شأنها أن تؤدي إلى التقليل من التخفيف عامل AWF 12،21. عدم وجود انتعاش النيلي اللون القرمزي قد يكون راجعا إلى قابليته للانشقاق إلى سلفونات إيزاتين التي كتبها الفائق 23، والذي يعرف إلى أن يتم إنتاجها في الممر الخلوي الغشائي، خصوصا في ظل التوتر 24. سوف انشقاق النيلي اللون القرمزي إلى سلفونات إيزاتين يؤدي إلى فقدان الامتصاصية في 610 نانومتر وزيادة في 245 نانومتر. ما إذا كان يحدث هذا التفاعل إلى حد ملموس في الممر الخلوي الغشائي، أو ما إذا كان هذا رد فعل يمكن مستعمل بإضافة الزبالين الفائق لinfiltratلم يتم التحقيق السائل أيون حتى الآن. وقد استخدم اللون الأزرق ديكستران بدلا من النيلي اللون القرمزي لالكمي لعامل التخفيف AWF في الأرز يترك 12، على الرغم من استقرارها والانتعاش في AWF لم يتم الإبلاغ عنها. بدلا من ذلك، المركبات radiolabelled مثل [14 C] السوربيتول أو معايير قابلة للقياس الكمي الداخلية الأخرى يمكن استخدامها بدلا من الأصباغ وانخفاض في النشاط الإشعاعي أو تركيز قياس والمستخدمة لحساب عامل التخفيف بطريقة مماثلة 11،14،25.
القيود المفروضة على تقنية
وتوجد هناك بعض المحاذير للتسلل الطرد المركزي طريقة AWF العزلة. أولا، التخفيف من الممر الخلوي الغشائي خلال تسلل قد تثير ردا من النبات. إذا كانت الخلايا المحيطة بها ورقة كشف تركيز تقلص لمكونات معينة من السوائل apoplastic، فإنها قد الاستجابة من قبل التغوط المزيد من نواتج الأيض، أو تحريف تفسير تركيزات المستقلب. فيتقييم لهذه المشكلة لوحظ أن أيا من الوقت بين عمليات التسلل والطرد المركزي ولا الخلافات المعتدلة في القوة الأيونية من السائل تسلل أثرت على تكوين AWF استخراج 14،22. ولذلك، أي القطع الأثرية الناتجة عن الممر الخلوي الغشائي ويعتقد أن التخفيف ليكون ضئيلا للغاية.
والعيب المحتمل الثاني هو أن شطف من AWF بواسطة الطرد المركزي لا يعبر عن الجزيئات الموجودة في الممر الخلوي الغشائي لعدة أسباب. بعض المركبات، في الكاتيونات والبروتينات معينة قد تكون مرتبطة بشكل وثيق مع جدار الخلية سالبة الشحنة وليس أزل مع AWF 13. الجزيئات الأخرى مثل البروتينات قد تكون كبيرة جدا لأزل بكفاءة من الممر الخلوي الغشائي في سرعات الطرد المركزي المستخدمة 14. أنواع الاكسجين التفاعلية هي فئة هامة من مجمع المنتجة في الممر الخلوي الغشائي، ولكن نظرا لطبيعة قصيرة الأجل من هذه المركبات، ومتطلبات غير محددة لإنتاجها، والعلاقات العامة الخاصة بهمesence لا يتم التقاطها بشكل جيد من قبل استخراج AWF. ومن غير المعروف ما مدى دقة يمثل AWF تكوين في الجسم الحي من السائل الممر الخلوي الغشائي وهذا قد تختلف بين الأنواع.
وتوجد عدة فحوصات لتحديد التلوث حشوية، رغم أن أيا مقبولة عالميا. فحوصات الإنزيمات في الغالب حشوية (على سبيل المثال، G6PDH، مصاوغة هيكسوز الفوسفات، مليون درهم) لديها مصلحة كونها سهلة لأداء ولكن قد لا يتماشى بشكل جيد مع تسرب حشوية 14،18. تقييم نواتج الأيض حشوية (على سبيل المثال، والفوسفات هيكسوز، الكلوروفيل) هو ربما يكون أكثر دلالة ولكن أقل راسخة 11. ومع ذلك، أي نوع من الفحص يمكن أن تكون مفيدة لتقدير النسبي للتلوث apoplastic بين العينات. من الناحية المثالية، ينبغي أن تستخدم قياسات مستقلة متعددة للتحقق من صحة سلامة العينة AWF.
مع الاعتراف حدوده، تسلل-centrifugatiعلى تقنية الموضحة هنا لا تزال تقنية بسيطة وقوية في دراسة البروتينات apoplastic، مستقلبات الابتدائية والثانوية والأيونات غير العضوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
References
- Felle, H. H. Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley. Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).
- Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction. The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).
- Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean. Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).
- Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria. Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).
- Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
- Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study. Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).
- Brunner, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).
- Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars. European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).
- Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport. Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).
- Dragišić Maksimović, J. L., et al. Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots. Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).
- Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).
- Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
- Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
- Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).
- Bergmeyer, H. U. Malate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).
- Lohr, G. W., Waller, H. D. Glucose-6-phosphate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).
- Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
- Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).
- Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
- Shabab, M., et al. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato. Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).
- Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. Solutes in the free space of growing stem tissues. Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).
- Husted, S., Schjoerring, J. K. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus. L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).
- Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid. The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).
- Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method. Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).
- Speer, M., Kaiser, W. M. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).
